[发明专利]一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用有效
| 申请号： | 201510086464.3 | 申请日： | 2015-02-17 |
| 公开（公告）号： | CN104651342B | 公开（公告）日： | 2018-06-01 |
| 发明（设计）人： | 黄潇;李岿然;党佳佳;李辉;赵阳国;白洁;张颖 | 申请（专利权）人： | 中国海洋大学 |
| 主分类号： | C12N11/02 | 分类号： | C12N11/02;C02F3/34;C12R1/01;C02F101/16 |
| 代理公司： | 青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201 | 代理人： | 张中南 |
| 地址： | 266100 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用。首先筛选出高效氨氧化细菌，对其进行耐盐和耐冷性驯化得到被驯化的Ochrobactrum.sp和Aquamicrobium.sp，再将制备好的生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中对生物炭球挂膜后与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液混合，最后将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液后放置冰箱交联、清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。显然本发明利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷氨氧化细菌，载体材料因地制宜来源广泛，制法简单，易于产业化，耐盐耐冷氨氧化细菌固定化的生物炭球应用于低温高盐的氨氮污染水体净化，微生物量大，机械强度高，处理效果好，费用低，无需回收，且对环境也不会造成二次污染。 | ||
| 搜索关键词： | 氨氧化细菌 耐盐 耐冷 生物炭 固定化 混合液 驯化 应用 饱和硼酸溶液 固定化生物 氨氮污染 二次污染 水体净化 微生物量 载体材料 载体固定 产业化 富集液 耐冷性 包埋 放入 高盐 挂膜 交联 炭球 制备 制法 逐粒 清洗 冰箱 筛选 回收 | ||
【主权项】：
1.一种以生物炭球为载体的耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法，其特征是首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐和耐冷性驯化得到耐盐耐冷氨氧化细菌，其次将制得的数个生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将所述挂膜生物炭球置于与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液中，并放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球；上述高效氨氧化细菌的筛选方法，包括如下步骤：（1）富集培养：称取干重10g-20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于所述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH4 )2 SO4 5.5g，CaCO3 5.5g，NaCl2.0g，MgSO4 0.5g，K2 HPO4 1.5g，MnSO4 0.01g，FeSO4 0.02g，蒸馏水1000mL，5%Na2 CO3 调节pH=8.0，121℃灭菌30min；（2）纯化分离：将所述氨氧化菌富集液按10-1 -10-7 梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化细菌，上述培养基为：NH4 SO4 2g，NaH2 PO4 0.25g，MgSO4 ·7 H2 O 0.03g，MnSO4 ·4H2 O 0.01g，K2 HPO4 0.75g，NaCl 0.01g，CaCO3 5g，琼脂 20g蒸馏水1000mL，5%Na2 CO3 调节pH=7.2，121℃灭菌30min；上述氨氧化细菌的耐盐和耐冷性驯化方法，包括如下步骤：（1）耐盐性驯化：将所述分离得到多株纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液，待所述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与富集培养基5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐氨氧化细菌；（2）耐冷性驯化：将所述筛选出的耐盐氨氧化细菌以富集液与富集培养基5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐耐冷氨氧化细菌；上述生物炭球挂膜方法：将生物炭球置于所述耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中浸泡4-6天，得到挂膜生物炭球；所述的包埋混合液是10%聚乙烯醇的水溶液和20%的湿菌体按体积（10-15）：1的比例混合得到的，所述湿菌体是取50ml-100ml的微生物富集液经5000-8000r/min离心10-15min,去除上清液后用无菌水清洗若干次次后得到的；上述生物炭球的制备方法，包括如下步骤：（1）取秸秆洗净，烘干至恒重，将秸秆粉碎后过筛得到秸秆粉末，经过马弗炉烧制成生物炭；（2）将所述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作为改性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，进行改性一天后，再用去离子水清洗至pH为中性得到化学改性生物炭；再将所述的化学改性生物炭置于频率40Hz的微波清洗仪中微波震荡40min-90min，过滤，恒温干燥后得到物化改性生物炭；（3）再将粘土在恒温干燥箱中干燥，过100目-200目筛得到粘土粉末；（4）将所述物化改性的生物炭与粘土粉末按质量比为（0.5-1）：10的比例混合后，加入到硅酸钠和碳酸氢钠用去离子水溶解的混合液中，用制球机制成球粒后，再置于恒温干燥箱中干燥，最后置于马弗炉烧制成生物炭球，所述硅酸钠与粘土质量比为3%，碳酸氢钠与粘土质量比为1.5%；上述马弗炉的烧制条件皆为：升温速度10℃/min, 温度为300℃-400℃和保温时间180min，恒温干燥条件皆为60℃-80℃条件下干燥8h-12h 。
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- 2018-04-25 - 2018-09-04 - C12N11/02
- 本发明涉及产L‑乳酸重组基因工程菌的固定化及其应用，将乳酸脱氢酶基因,整合进光滑球拟酵母菌基因,形成重组DNA基因；通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体，构建合成L‑乳酸的工程菌；将硅酸钠、十六烷基三甲基溴化胺、氯化铵和三氯化铝在水相及超分子自组装条件下，制备孔径为25～45nm的超大比表面积的超分子自组装模板；将上述超分子自组装模板,采用物理吸附法固定上述重组基因工程菌，并在含葡萄糖限制性培养基中发酵制备L‑乳酸，产物表达量可达23.5g/L，葡萄糖转化率68.51%，重复利用30次，产物表达量和葡萄糖转化率为22.6g/L和65.87%。
- 一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用-201510086464.3
- 黄潇;李岿然;党佳佳;李辉;赵阳国;白洁;张颖 - 中国海洋大学
- 2015-02-17 - 2018-06-01 - C12N11/02
- 一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用。首先筛选出高效氨氧化细菌，对其进行耐盐和耐冷性驯化得到被驯化的Ochrobactrum.sp和Aquamicrobium.sp，再将制备好的生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中对生物炭球挂膜后与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液混合，最后将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液后放置冰箱交联、清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。显然本发明利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷氨氧化细菌，载体材料因地制宜来源广泛，制法简单，易于产业化，耐盐耐冷氨氧化细菌固定化的生物炭球应用于低温高盐的氨氮污染水体净化，微生物量大，机械强度高，处理效果好，费用低，无需回收，且对环境也不会造成二次污染。
- 一种青霉素酰化酶固定化载体及其制备方法-201711015061.5
- 陈振斌;王旭东;李轲;张霞云;段成龙;贾伟炜 - 兰州理工大学
- 2017-10-25 - 2018-04-17 - C12N11/02
- 本发明公开了一种青霉素酰化酶固定化载体及其制备方法，属于材料科学与工程领域，包括各个反应物质量比为TiO2戊二醛乙醇＝1013177。固定化PGA活力范围为11000‑14000U/g、对应游离酶负载量范围13000‑15000U/g、酶活回收率范围为80‑90％，重复使用12次后，其酶活保留率为60％。
- 一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法与应用-201510086209.9
- 李岿然;黄潇;党佳佳;李辉;田伟君;赵阳国;白洁;陈玲 - 中国海洋大学
- 2015-02-17 - 2018-01-30 - C12N11/02
- 一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法和应用。首先分别筛选出高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌，对其进行耐盐和耐冷性驯化，分别得到被驯化的Kuenenia.Anammoxidans，Ochrobactrum.sp和Flavobacterium mizutaii。再将制备好的生物炭球置于耐盐耐冷高效复合降解菌富集液中对生物炭球挂膜后与耐盐耐冷高效降解菌包埋复合液混合，最后将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液后放置冰箱交联、清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球。应用于低温高盐条件氨氮和石油烃污染水体的净化，微生物量大。显然本发明利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷复合菌种，其载体材料来源广泛，制法简单，易于产业化，机械强度高，处理效果好，费用低，对环境也不会造成二次污染。
- 一种兼具沼气产量增效作用的沼渣分解剂及其应用-201711014120.7
- 胡岩林 - 南昌牧龙生物科技有限公司
- 2017-10-25 - 2018-01-19 - C12N11/02
- 本发明提供了一种兼具沼气产量增效作用的沼渣分解剂及其应用，属于生物技术领域。一种兼具沼气产量增效作用的沼渣分解剂，纤维素酶和木聚糖酶会对沼渣中未消化利用饲料残渣进行酶解，将残渣中粗纤维植物长链纤维降解为容易被微生物吸收利用的短链纤维，同时对残渣中植物细胞壁进行酶解，释放出的木聚糖、非淀粉多糖经过水解转化生成易于被微生物吸收利用的葡萄糖等单糖。在酶解过程中形成的短链植物纤维及葡萄糖等单糖在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的作用下进行消化分解，进一步对残渣、沼渣进行分解，从而达到快速分解沼渣的效果。
- 一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法-201710943173.0
- 肖乃东;蒋蕊;周文兵;朱端卫;胡金龙;杨特武 - 华中农业大学
- 2017-10-11 - 2018-01-09 - C12N11/02
- 本发明涉及一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法，属于解磷菌的应用技术领域。所述的解磷菌固体菌剂以甘蔗渣为载体、海藻酸钠为保护剂、磷酸氢钙为粘结剂，制作过程依次包括解磷菌活化、解磷菌发酵培养、菌悬液制备、固体菌剂制作和菌株活力测定。本发明所述的解磷菌菌株为解淀粉芽孢杆菌，环境适应能力强。本发明以甘蔗渣为载体不仅实现了废弃植物生物质的资源化利用，而且原料廉价易得可降解。本方法制成的固体菌剂经长时间保存后解磷菌仍保持较高活性，施入土壤后解磷菌能够提高土壤中难溶性磷的利用效率，甘蔗渣还可增加土壤中有机质的含量，具有良好的应用潜力。
- 一种酵母的固定化方法-201711073074.8
- 孟开峰 - 孟开峰
- 2017-11-04 - 2018-01-09 - C12N11/02
- 本发明涉及一种酵母的固定化方法，属于离子交换树脂技术领域。本发明从酵母体积大，传统酶载体孔径太小的特点出发，根据大孔树脂致孔原理，选择了具有较大孔径的大孔强碱阴离子交换树脂作为酵母固定化载体。以该树脂作为酵母固定化载体，通过吸附法将液态酵母固定在树脂上，能一步有效完成对酵母的固定化。本发明工艺简单易行，固定化后酵母活性的回收率较高。
- 脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法-201410433204.4
- 程海明;宋德伟;陈敏;李志强 - 四川大学
- 2014-08-28 - 2017-12-26 - C12N11/02
- 本发明公开的脂肪酶固定化载体是以皮胶原为基材，与交联剂依次在酸性条件和中偏碱性条件下进行交联后，用中性缓冲溶液冲洗除去未反应的交联剂即可，所得载体的游离醛基含量为0.5～5.0mmol/g，干热变性温度为80～100℃，比表面积为2.0～20m2/g。本发明还公开了利用前述的脂肪酶固定化载体来固定脂肪酶的方法，该方法所得固定化脂肪酶活力在70U/g以上，常温下保存一个月后，酶活力在95％以上。本发明提供的载体原材料来源丰富，天然可再生，价格低廉，且比表面积大，化学性能稳定，热稳定性高，制备成本低，固定的脂肪酶活力及活力保持率高，常温下存放1个月，酶的活性仍能保持95％以上。
- 用于包封益生菌的微粒，获得所述微粒的方法及其用途-201380046390.X
- 迈特·阿古罗斯巴佐;艾琳·埃斯帕扎卡塔兰;卡洛斯·加马索德拉拉西利亚;卡洛琳娜·冈萨雷斯费雷罗;卡洛斯哈维尔·冈萨雷斯纳瓦罗;胡安曼努埃尔·伊拉切加雷塔;丽贝卡·佩尼亚尔瓦索夫龙;安娜·罗莫瓦尔德;拉克尔·比尔托雷萨诺 - 国家食品安全与技术中心埃布罗实验室;纳瓦拉大学
- 2013-07-05 - 2017-11-17 - C12N11/02
- 本发明涉及包含由酪蛋白和壳聚糖形成的基质和益生菌的微粒；所述基质在（i）加工，（ii）存储和（iii）通过胃肠道转运期间保护所述益生菌，延长它们的寿命。本发明还涉及获得所述微粒的方法，包含所述微粒的产品及组合物。
- 一种高效催化制备生物柴油用新型纤维生物基固定化全细胞催化剂及其制备方法-201510172576.0
- 王飞;何琦阳;李治林;李迅;张瑜 - 南京林业大学
- 2015-04-14 - 2017-10-27 - C12N11/02
- 本发明公开了一种能够高效催化制备生物柴油的新型纤维生物基材料固定化全细胞催化剂及其制备方法,所述的全细胞催化剂通过如下步骤制备产脂肪酶真菌孢子悬浮液的制备；固定化载体的预处理；固定化全细胞生物催化剂的制备；固定化全细胞生物催化剂的交联处理。本方法的固定化全细胞生物催化剂具有制备方法简单、固定效果好和成本低等优点，采用本方法固定化全细胞生物催化剂催化植物油甲酯化催化制备生物柴油，催化剂重复使用6次，脂肪酸甲酯得率稳定在82%以上，且反应条件温和，甲醇添加量低，原料适用性广，使得该工艺更具有经济竞争性。
- 一种植物生长调节剂应用于链霉菌菌剂制备的方法-201710515658.X
- 高筱莎;常大勇;常晓菲 - 烟台固特丽生物科技股份有限公司
- 2017-06-29 - 2017-09-29 - C12N11/02
- 本发明涉及一种植物生长调节剂应用于链霉菌菌剂制备的方法，包括如下步骤1)菌种摇床培养；2)种子液制备；3)发酵液制备；4)菌剂的固定。本发明采用三级发酵方式实现一种产纤维素酶的链霉菌剂的工业化生产。尤其是在种子罐和发酵罐培养过程中添加植物生长调节剂如三十烷醇、复硝酚钠、胺鲜酯等，可显著缩短种子生长周期，提高链霉菌生产效率，该菌剂纤维素酶活高，可有效降解果树枝条、秸秆、木薯渣等，制备生物有机肥，创造可观的经济效益。
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