[发明专利]在毕赤酵母中使用甲醛脱氢酶启动子指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达的方法

摘要

本发明涉及在甲醇营养型毕赤酵母宿主细胞中表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的方法，其中人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达受毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子的控制，本发明主要包含：i）构建毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子指导的毕赤酵母表达载体；ii）甲醛脱氢酶启动子指导下，在不同碳氮源组合培养基中表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1。本发明将基于甲醇酵母表达系统，通过从甲醛脱氢酶启动子的调控特点着手，依据其特点在不同碳氮源培养基中，进行人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的优化表达，实现人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的高效表达，从而获得低成本的病毒样颗粒制备技术，实现低成本人乳头瘤病毒疫苗制备。

主权项

毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子指导的毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），将甲醛脱氢酶启动子基因片段进行PCR扩增，扩增后的基因片段纯化后，亚克隆进TA克隆载体pMD®18‑T，得到PFLD‑pMDTM18‑T载体；所述的PCR扩增引物为：上游引物（5’端）为gtagatctgcatgcaggaatctctggca，下游引物（3’端）为gtgaattcgagacctgtgaatatcaagaattgtatga；步骤（2），将步骤（1）得到的PFLD‑pMDTM18‑T载体和毕赤酵母质粒pPink‑HC进行双酶切，连接酶连接过夜，得到质粒pPinkFLD‑HC；步骤（3），将步骤（2）得到的质粒pPinkFLD‑HC和毕赤酵母质粒pPinkAOX1‑HPV16L1进行双酶切，连接酶连接过夜，得到连接产物质粒pPinkFLD‑HPV16L1；步骤（4），步骤（3）得到的连接产物质粒pPinkFLD‑HPV16L1转化大肠杆菌DH5α扩增后，用限制性内切酶SpeⅠ酶切，纯化回收酶切线性化质粒；步骤（5），将步骤（4）得到的纯化回收的酶切线性化质粒电转化毕赤酵母PichiaPinkTMStrainⅠ感受态细胞，经过毕赤酵母腺嘌呤缺陷平板筛选得到质粒pPinkFLD‑HPV16L1表达克隆子。