[发明专利]在毕赤酵母中使用甲醛脱氢酶启动子指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种在甲醇营养型毕赤酵母宿主细胞中使用毕赤酵母甲醛脱氢酶（FLD）启动子指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1（HPV 16L1）表达的方法。

背景技术

毕赤酵母表达系统能有效地分泌异源蛋白，并进行真核翻译后修饰，操作简便易于实现高密度发酵，且不产生内毒素及哺乳动物细胞核酸成分等，因此，是一个广泛应用的蛋白表达系统。转录是基因表达调控最关键的环节之一，启动子可显著影响异源基因转录的起始、水平及持续，从而直接影响异源蛋白的表达效率。毕赤酵母中最常用、最经典的启动子是醇氧化酶1型启动子（AOX1），该启动子具有严格的甲醇调控能力，使用毕赤酵母醇氧化酶1型启动子已成功指导了上百种重组蛋白的表达。尽管醇氧化酶1型启动子能够指导异源蛋白大量表达，但由于甲醇有毒且易燃，为安全和大规模生产带来问题，同时并不是所有异源蛋白都适合这样高水平的表达调控，如果蛋白的正确折叠和加工是蛋白分泌途径上的限速步骤，那么单位时间内大量表达的异源蛋白由于来不及进行修饰折叠，最终导致这些未成熟的蛋白进入泛素化降解途径，相反地使蛋白产量降低。

因此避免甲醇的使用寻找另一些替代的启动子则是一个有效的策略。毕赤酵母甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子（GAP）是另一个常用的毕赤酵母启动子，该启动子属于组成型启动子，无需诱导，对于无毒性蛋白的表达具有简便、经济的优势。

尽管组成型启动子简化了生产步骤，但若获得较高的蛋白产量，对菌体的生长状况要求较高，并且其调控途径比较单一，蛋白表达的种类受限。因此一个强的具备多种调控途径的启动子具有很好的开发应用价值，对于异源蛋白的表达研究具有重要意义。

在毕赤酵母中，谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶(FLD)启动子就是一个具备多种调控途径的启动子。甲醛脱氢酶是参与酵母甲醇代谢和烷胺类物质代谢途径的主要酶。从毕赤酵母中分离得到的甲醛脱氢酶基因编码379个氨基酸，与n-烷烃-同化酵母麦芽糖假丝酵母的甲醛脱氢酶和人类及其它真核生物的脱氢酶Ⅲ类酶的甲醛脱氢酶分别具有71%和61%～65%的核苷酸序列同源性。甲醛脱氢酶将醇氧化酶氧化甲醇产物甲醛氧化，甲醛氧化产物经甲酸脱氢酶后变为二氧化碳。甲醛脱氢酶同时参与烷胺类物质代谢，胺类物经胺类氧化酶氧化形成甲醛，之后经甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶87作用后，产生二氧化碳并同化为生物量。甲醛脱氢酶的合成可以独立地被以甲醇作为唯一碳源和能源，或以甲胺作为唯一氮源调控。在葡萄糖和铵盐离子培养基中，甲醛脱氢酶表达水平很低；然而在甲醇-铵离子或葡萄糖-甲胺培养基中，甲醛脱氢酶表达水平却很高。

甲醛脱氢酶启动子已成功用于一些蛋白在毕赤酵母中的表达。使用甲醛脱氢酶启动子可以使成熟形式的米根霉脂肪酶获得高水平的表达量，最大产量达386 AU/ml，克服了醇氧化酶1型启动子指导的米根霉脂肪酶的过表达对细胞生长带来的负效应，突破了米根霉脂肪酶的分泌瓶颈。使用甲醇作为碳源和甲胺作为氮源的组合对蛋白产量具有协同增强效应，而甲醇和硫酸铵碳氮源组合培养基则显示出最好的表达能力，在发酵培养基中表达米根霉脂肪酶可达到300Uh^-1的产量。然而甲胺作为氮源，当同作为碳源的山梨醇组合使用时也能很好地诱导米根霉脂肪酶的表达。研究表明，无论是以甲醇或是甲胺进行诱导，甲醛脱氢酶启动子的强度均不弱于毕赤酵母醇氧化酶1型启动子。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种在甲醇营养型毕赤酵母中使用甲醛脱氢酶启动子调控人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达的方法，其中人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达受毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子的控制。

本发明采用的技术方案如下：

毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子指导的毕赤酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤（1），将甲醛脱氢酶启动子基因片段进行PCR扩增，扩增后的基因片段纯化后，亚克隆进TA克隆载体pMD^?18-T，得到P_FLD-pMD^TM18-T载体；

所述的PCR扩增引物为：上游引物（5’端）为gtagatctgcatgcaggaatctctggca，下游引物（3’端）为gtgaattcgagacctgtgaatatcaagaattgtatga；