[发明专利]在毕赤酵母中使用甲醛脱氢酶启动子指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达的方法

权利要求书

1.毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子指导的毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），将甲醛脱氢酶启动子基因片段进行PCR扩增，扩增后的基因片段纯化后，亚克隆进TA克隆载体pMD^?18-T，得到P_FLD-pMD^TM18-T载体；

所述的PCR扩增引物为：上游引物（5’端）为gtagatctgcatgcaggaatctctggca，下游引物（3’端）为gtgaattcgagacctgtgaatatcaagaattgtatga；

步骤（2），将步骤（1）得到的P_FLD-pMD^TM18-T载体和毕赤酵母质粒pPink-HC进行双酶切，连接酶连接过夜，得到质粒pPinkFLD-HC；

步骤（3），将步骤（2）得到的质粒pPinkFLD-HC和毕赤酵母质粒pPinkAOX1-HPV16L1进行双酶切，连接酶连接过夜，得到连接产物质粒pPinkFLD-HPV16L1；

步骤（4），步骤（3）得到的连接产物质粒pPinkFLD-HPV16L1转化大肠杆菌DH5α扩增后，用限制性内切酶SpeⅠ酶切，纯化回收酶切线性化质粒；

步骤（5），将步骤（4）得到的纯化回收的酶切线性化质粒电转化毕赤酵母PichiaPink^TMStrainⅠ感受态细胞，经过毕赤酵母腺嘌呤缺陷平板筛选得到质粒pPinkFLD-HPV16L1表达克隆子。

2.根据权利要求1所述的毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子指导的毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系包括2微升10×Extaq酶缓冲液，1.6微升dNTP混合物，50微摩尔浓度的上、下游引物各0.25微升，0.5微升Extaq酶，2微升毕赤酵母细胞系GS115菌液，双蒸水13.4微升；

所述的PCR扩增反应条件为95℃，预变性3分钟；72℃，热启动2分钟，同时，向反应体系中加入高保真taq酶；之后95℃，变性30秒；52℃，退火40秒；72℃，延伸1分钟；最后72℃，再延伸10分钟，共34个循环。

3.根据权利要求1所述的毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子指导的毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征在于，步骤（2）的具体操作如下：用限制性内切酶BglⅡ和BsaⅠ(+EcoRⅠ)双酶切步骤（1）得到的P_FLD-pMD^TM18-T载体后所得甲醛脱氢酶启动子片段P_FLD，与限制性内切酶BglⅡ和EcoRⅠ双酶切质粒pPink-HC所得载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化，涂板，得到质粒pPinkFLD-HC；

酶切质粒P_FLD-pMD^TM18-T反应体系为：质粒P_FLD-pMD^TM18-T0.56μg/μl 10微升，BglⅡ1微升，BsaⅠ(+EcoRⅠ) 1微升，10×T buffer 3微升，0.1%BSA 0.3微升，双蒸水14.7微升；

酶切质粒pPink-HC反应体系为：质粒pPink-HC 0.73μg/μl 10微升，BglⅡ1.5微升，EcoRⅠ1.5微升，10×H buffer 3微升，双蒸水14微升；

连接反应体系为：片段P_FLD1微升，载体1微升，10×T4 buffer 1微升，T4连接酶 1微升，双蒸水6微升；其中，片段P_FLD和载体的连接摩尔浓度比为1:3。