[发明专利]基于利用杂交-捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸分析的在固相中的靶核酸序列检测

摘要

本发明涉及通过利用杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTO Cleavage and Extension using hCTO，PC E‑hCTO)分析，在固相中，从脱氧核糖核酸(DNA)或核酸混合物检测靶核酸序列。根据本发明，延伸二聚物以靶‑依赖性方式在液相中形成，接着，在固相中检测延伸二聚物的存在。杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸(hCTO)不固定于固相，因此，在液相中，更加有效地形成上述延伸二聚物。

主权项

一种通过利用杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸分析，在固相中，从脱氧核糖核酸或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸杂交，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’‑靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’‑标记部位，包含与上述靶核酸序列非‑互补的核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸的3’‑靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’‑标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割，上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位或5’‑标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸杂交，上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸包含：(i)捕捉和模板化寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含捕捉部位及模板化部位，上述捕捉部位包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位或5’‑标记部位的一部分互补的核苷酸序列，上述模板化部位包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位及3’‑靶向部位非‑互补的核苷酸序列；以及(ii)在上述捕捉和模板化寡核苷酸的3’‑末端或5’‑末端包含固定化寡核苷酸‑杂交部位，上述固定化寡核苷酸‑杂交部位包含与固定于固相底物上的固定化寡核苷酸互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的片段与上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板‑依赖性核酸聚合酶进行延伸反应，与上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸，来形成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有能够通过(i)上述片段的序列和/或长度、(ii)上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(ⅲ)上述片段的序列和/或长度和上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度进行调节的T_m值，上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的固定化寡核苷酸‑杂交部位维持单链状态；步骤(e)，使上述单链状态的杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的固定化寡核苷酸‑杂交部位与上述固定化寡核苷酸杂交，固定于上述固相底物上的上述固定化寡核苷酸包含与上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的固定化寡核苷酸‑杂交部位互补的核苷酸序列，上述固定化寡核苷酸与上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的固定化寡核苷酸‑杂交部位杂交，来形成固定化寡核苷酸二聚物，上述延伸二聚物通过(i)与上述片段和/或上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸相连接至少一个标记、(ii)在进行上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记、(ⅲ)在进行上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记及与上述片段和/或上述杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(ⅳ)与上述片段相连接的标记或在进行上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记以及与上述固定化寡核苷酸相连接的标记提供靶信号；以及步骤(f)，在上述延伸二聚物及上述固定化寡核苷酸二聚物均维持双链状态的指定温度下检测上述靶信号，由此在固相中检测上述延伸二聚物，上述延伸二聚物的存在表示上述靶核酸序列的存在。