[发明专利]基于利用杂交-捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸分析的在固相中的靶核酸序列检测

说明书

本发明涉及通过利用杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTO Cleavage and Extension using hCTO，PC E‑hCTO)分析，在固相中，从脱氧核糖核酸(DNA)或核酸混合物检测靶核酸序列。根据本发明，延伸二聚物以靶‑依赖性方式在液相中形成，接着，在固相中检测延伸二聚物的存在。杂交‑捕捉和模板化寡核苷酸(hCTO)不固定于固相，因此，在液相中，更加有效地形成上述延伸二聚物。

对于相关申请的交叉参照

本专利申请对2013年10月18日向韩国专利厅提出的韩国特许申请第2013-0124589号主张优先权，上述专利申请的公开事项插入于本说明书中作为参照。

技术领域

本发明涉及基于利用杂交-捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PCE-hCTO，PTO Cleavage and Extension using hCTO)分析的在固相中的靶核酸序列检测。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)杂交(hybridization)是分子生物学的基本过程，受离子强度、碱基组成、核酸片段的长度、错配程度以及变性剂的存在的影响。基于脱氧核糖核酸杂交的技术为对确定特定核酸序列非常有用的用具，明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。

但是，在主要仅依赖于杂交的现有的方法以及过程中，发生由探针与非-靶序列之间的非-特异性杂交引起的假阳性结果的可能性高。因此，现有的方法以及过程存在需要改善可靠性的问题。

除了探针杂交过程之外，还提出了利用酶反应的几种接近法，例如，TaqMan^Tm探针方法。

在TaqMan^TM探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记探针被上游引物-依赖性脱氧核糖核酸聚合酶的5’核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列存在的信号(美国专利第5210015号、第5538848号以及第6326145号)。TaqMan^TM探针方法提出用于信号产生的两个接近法，即，聚合-依赖性切割(polymerization-dependent cleavage)以及聚合-独立性切割(polymerization-independent cleavage)。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延伸必须在核酸聚合酶与标记探针的5’-末端相接触之前发生。随着延伸反应的进行，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚合-独立性切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此与靶核酸序列杂交，上游引物的3’-末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合酶与标记探针的5’-末端相接触来放出标记。并且，TaqMan^TM探针方法公开如下：在标记探针的5’-末端具有不与靶序列杂交的5’-尾巴区域的标记探针被切割，来形成包含5’-尾巴区域的片段。

也有具有与靶序列非-互补的5’-尾巴区域的探针被5’核酸酶切割，来放出包含5’-尾巴区域的片段的几种方法的报告。

例如，美国专利第5691142号中公开了被脱氧核糖核酸聚合酶的5’核酸酶活性切割的切割结构。公开中例示了包含与模板(template)非-互补的5’部位以及与模板互补的3’部位的寡核苷酸与模板杂交，上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板杂交的切割结构。上述切割结构被具有5’核酸酶活性的脱氧核糖核酸聚合酶或具有减少的合成活性的变异脱氧核糖核酸聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5’部位。之后，被放出的上述5’部位与具有发夹结构的寡核苷酸杂交，来形成切割结构，由此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。