[发明专利]一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法

摘要

一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，通过ELISA方法从蝴蝶兰检测到齿兰环斑病毒ORSV-GZ，利用其枯斑寄主苋色黎进行纯化，RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白CP基因并将其克隆至pMD18-T载体后测序并进行核苷酸序列分析。本发明从分子水平对ORSV蝴蝶兰分离物进行鉴定，完成了该病毒分离物的分子鉴定，为兰花病毒的检测、防控及兰花种质资源的保护提供理论基础。

主权项

一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：1)采集表现出病毒病症状的蝴蝶兰样品，经过ELISA检测为ORSV阳性后摩擦接种于苋色藜，单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV‑GZ；2)称取感染ORSV‑GZ的新鲜苋色黎叶片，提取其总RNA，于‑80℃保存备用；3)根据GenBank已报道的ORSV外壳蛋白基因设计引物，上游引物：ORSV‑CP‑F为：5′‑CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC‑3′，下游引物ORSV‑CP‑R为：5′‑CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT‑3′；以1μL提取的总RNA为模板，进行一步RT‑PCR扩增ORSV的CP基因，PCR反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，反应30个循环；72℃延伸10min；取1μL RT‑PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，应在约477bp左右观察到DNA条带；4)将上步获得的RT‑PCR产物进行纯化，RT‑PCR产物纯化后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，将RT‑PCR产物即ORSV CP基因克隆至pMD18‑T载体中；5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行振荡培养，在37℃、200rpm调价下持续16h后，采用菌液PCR的方法对各培养物进行阳性重组子的筛选；6)采用DNAMAN7.0软件对ORSV‑GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源性分析，利用MEGA5.0软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor‑Joining聚类分析方法。