[发明专利]一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法。

背景技术

齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)，隶属烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，基因组为(+)ssRNA。其外壳蛋白(Coat protein，CP)基因的ORF长度为477bp，编码158个氨基酸残基，蛋白分子量约为18.0kDa，病毒颗粒呈杆状，无包被，长约300nm，宽约18nm，螺旋对称，螺纹明显，颗粒中轴有沟状构造，病毒颗粒分散在细胞质内呈晶格排列。ORSV在世界各地商业生产的兰花中分布非常广泛，至少可以感染包括文心兰属(Oncidium)在内的35种兰属，其所导致的病变症状主要是花叶、环斑、碎色等。除此之外，齿兰环斑病毒还常与建兰花叶病毒(CymMV)复合侵染兰花，使其叶片形成不规则的褪绿、条纹、圆斑甚至坏死等症状，进而导致植株生长不良、花小而少，花期缩短等，使兰花的商业价值大打折扣。

近年来，随着兰花市场和种植规模的不断发展，兰花病虫害的发生也日趋严重，其中以病毒病的危害最重，这些都对兰花产业的健康发展构成极大的威胁。本发明采用血清学和分子生物学技术(如ELISA、RT-PCR等)从蝴蝶兰分离获得ORSV，克隆其CP基因并对其序列进行分析，完成了该病毒分离物的分子鉴定，为兰花病毒的检测、防控及兰花种质资源的保护提供理论基础。

发明内容

本发明旨在提供一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法。

本发明主要通过ELISA方法从蝴蝶兰检测到齿兰环斑病毒ORSV-GZ，利用其枯斑寄主苋色黎进行纯化，RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白(CP)基因并将其克隆至pMD18-T载体后测序并进行核苷酸序列分析。具体通过以下技术方案实现：

一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，包括以下步骤：

1)采集表现出花叶、褪绿、环斑、碎色的毒病症状的蝴蝶兰样品，经过ELISA检测为ORSV阳性后摩擦接种于苋色藜，三次单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV-GZ；

2)称取感染ORSV-GZ的新鲜苋色黎叶片，用RNAiso Plus试剂提取其总RNA，于-80℃保存备用；

3)根据GenBank已报道的ORSV外壳蛋白基因设计引物，上游引物：ORSV-CP-F为：5′-CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3′，下游引物ORSV-CP-R为：5′-CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT-3′，以1μL提取的总RNA为模板，进行一步RT-PCR扩增ORSV的CP基因，PCR反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，反应30个循环；72℃延伸10min，取1μL RT-PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，应在约477bp左右观察到DNA条带；

4)将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，RT-PCR产物纯化后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，将RT-PCR产物即ORSV CP基因与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α并做过夜培养；

5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行振荡培养16h(37℃，200rpm)，采用菌液PCR的方法对各培养物进行阳性重组子的筛选，提取重组质粒DNA并送上海生工进行基因测序；

6)采用DNAMAN7.0软件对ORSV-GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源性分析，利用MEGA5.0软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor-Joining聚类分析方法。

所述的病毒接种分离过程为：用500目的金刚砂喷洒苋色藜待接种叶片，将感染ORSV蝴蝶兰叶片于1％磷酸氢二钾溶液(1:10，m/V)中研磨提取(不超过2min)，并将提取液摩擦接种于苋色藜叶片，随后立即用清水冲洗叶片，洗去金刚砂和多余的溶液，5-10天后接种叶片应出现较明显的坏死小斑，剪取单个坏死斑点，采用上述接种方法重新接种至健康的苋色藜叶片，3次单斑分离后可获得单一病毒或病毒株系。