[发明专利]一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法

权利要求书

1.一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)采集表现出病毒病症状的蝴蝶兰样品，经过ELISA检测为ORSV阳性后摩擦接种于苋色藜，单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV-GZ；

2)称取感染ORSV-GZ的新鲜苋色黎叶片，提取其总RNA，于-80℃保存备用；

3)根据GenBank已报道的ORSV外壳蛋白基因设计引物，上游引物：ORSV-CP-F为：5′-CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3′，下游引物ORSV-CP-R为：5′-CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT-3′；以1μL提取的总RNA为模板，进行一步RT-PCR扩增ORSV的CP基因，PCR反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，反应30个循环；72℃延伸10min；取1μL RT-PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，应在约477bp左右观察到DNA条带；

4)将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，RT-PCR产物纯化后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，将RT-PCR产物即ORSV CP基因克隆至pMD18-T载体中；

5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行振荡培养，在37℃、200rpm调价下持续16h后，采用菌液PCR的方法对各培养物进行阳性重组子的筛选；

6)采用DNAMAN7.0软件对ORSV-GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源性分析，利用MEGA5.0软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor-Joining聚类分析方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)病毒接种分离过程为：用500目的金刚砂喷洒苋色藜接种叶片，将感染ORSV蝴蝶兰叶片于1％磷酸氢二钾溶液中研磨提取不超过2min，并将提取液摩擦接种于苋色藜叶片，随后立即用清水冲洗叶片，洗去金刚砂和多余的溶液；5-10天后接种叶片应出现较明显的坏死小斑，剪取单个坏死斑点，采用上述接种方法重新接种至健康的苋色藜叶片，3次单斑分离后获得单一病毒或病毒株系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：感染ORSV蝴蝶兰叶片与1％磷酸氢二钾溶液的质量体积比为1:10。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中PCR过程为取各培养物菌液100μL，12000rpm，离心1min，弃上清，用400μL无菌水重悬沉淀，沸水浴10min，12000rpm离心5min，上清即为模板；正向通用引物：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；反向通用引物：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，退火温度55℃：循环次数：25；取各PCR产物1μL进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，若在约600bp处出现条带，则提取其剩余菌液中的质粒进行测序。