[发明专利]一种以酿酒酵母孢子为载体的固定化酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种以酿酒酵母孢子为载体的固定化酶的制备方法及固定化酶，其通过使用一种酿酒酵母缺陷型菌株△dit1，此菌株产生的孢子壁不含最外的二酪氨酸层，暴露在最外面的一层是壳聚糖，将酶直接固定在此缺陷型的孢子上，得到固定化酶。本发明直接通过培养酿酒酵母△dit1菌株获得大量的酿酒酵母的子囊孢子，再加以破壁纯化得到目的产品，就可以做相应的应用，而无需获得像一般固定化酶所需的载体，方法简便，易于操作，节省费用。

主权项

一种以酿酒酵母孢子为载体的固定化酶的制备方法，其特征在于：包括，酿酒酵母单菌落的培养，采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SK1孢子壁最外层二酪氨酸层的DIT1基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，28℃～32℃培养至长出单菌落；孢子的制备，挑取单菌落到YPAD液体培养基中，摇床培养后，将菌液转接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，转到1％～3％的醋酸钾溶液中培养，使得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2×10⁷/ml～4×10⁷/ml，而后离心，将离心后的酿酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36℃～38℃下用一定量的lyticase处理0.5h～1.5h后，进行超声波破碎，得到游离状态的酿酒酵母孢子并对酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥，所述孢子的制备，YPAce培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸馏水中，121℃灭菌15min后，补加100mL单独灭菌的20％醋酸钾；酶的固定化，将β‑半乳糖苷酶固定到酿酒酵母DIT1基因缺陷型的孢子上，将经纯化的酿酒酵母△dit1孢子，用2％～3％的戊二醛溶液进行处理，然后洗涤酿酒酵母孢子，向酿酒酵母孢子中加入配制好的β‑半乳糖苷酶溶液，在3℃～5℃下进行固定，离心，洗涤，得到固定化的β‑半乳糖苷酶。