[发明专利]一种以酿酒酵母孢子为载体的固定化酶的制备方法

权利要求书

1.一种以酿酒酵母孢子为载体的固定化酶的制备方法，其特征在于：包括，

酿酒酵母单菌落的培养，采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母 SK1孢子壁最外层二酪氨酸层的DIT1基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在 YPAD固体培养基平板上划线，28℃～32℃培养至长出单菌落；

孢子的制备，挑取单菌落到YPAD液体培养基中，摇床培养后，将菌液转 接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，转到1％～3％的醋酸钾溶液中培养，使 得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2×10⁷/ml～4×10⁷/ml，而后离心，将离心后的酿 酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36℃～38℃下用一定量的lyticase处理0.5h～1.5 h后，进行超声波破碎，得到游离状态的酿酒酵母孢子并对酿酒酵母孢子进行纯 化和冷冻干燥，所述孢子的制备，YPAce培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白 胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸馏水中，121℃灭菌15min后，补加 100mL单独灭菌的20％醋酸钾；

酶的固定化，将β-半乳糖苷酶固定到酿酒酵母DIT1基因缺陷型的孢子上， 将经纯化的酿酒酵母△dit1孢子，用2％～3％的戊二醛溶液进行处理，然后洗涤 酿酒酵母孢子，向酿酒酵母孢子中加入配制好的β-半乳糖苷酶溶液，在3℃～5℃ 下进行固定，离心，洗涤，得到固定化的β-半乳糖苷酶。

2.根据权利要求1所述的以酿酒酵母孢子为载体的固定化酶的制备方法， 其特征在于：所述酿酒酵母单菌落的培养，YPAD固体培养基的配制为酵母提取 物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，琼脂20g，定容于900mL蒸馏水中，121℃ 灭菌15min后，补加100mL单独灭菌的20％葡萄糖。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于：所述对 酿酒酵母孢子进行纯化，包括，

配制Percoll溶液，将处理过的细胞用0.5％Triton X-100溶液洗涤，以除去 其中的裂解酶等杂质，然后将细胞悬浮在0.5％Triton X-100溶液中，配制不同梯 度50％～80％不同浓度梯度的Percoll溶液；

酿酒酵母孢子的纯化，将所述Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入 到离心管中，最后加酿酒酵母细胞悬浮液，离心，将上层液体除去，得到纯化 的酿酒酵母孢子。

4.一种采用如权利要求1～3任一方法制备的以酿酒酵母孢子为载体的固定 化酶，其特征在于：所述固定化酶是将β-半乳糖苷酶固定化到不含有二酪氨酸层 的酿酒酵母缺陷型孢子上。