[发明专利]一种以酿酒酵母孢子为载体的固定化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域和固定化酶技术，具体地说，本发明涉及一种 以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法。

背景技术

酵母菌泛指能发酵糖类的一大类单细胞真菌，最典型的酵母菌是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母在良好的营养和生长条件下，生长迅速， 以出芽繁殖的方式进行生殖。但以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源 等特定条件下(如只有乙酸钾存在)，酿酒酵母就会以孢子生殖的方式进行繁殖， 在胞内形成孢子。此时的细胞即称为子囊，子囊经自然或人为破壁后，可释放 出其中的子囊孢子。

壳聚糖是由几丁质经过脱乙酰反应得到的，其化学名称为聚葡萄糖胺 (1-4)-2-氨基-β-D-葡萄糖。曾有文献报道过壳聚糖可以被用来固定化酶，这是由 于壳聚糖的氨基可以被戊二醛容易激活，从而与酶结合。而酿酒酵母在以醋酸 盐为唯一或主要碳源的状态下在可以产生子囊孢子，其孢子壁由四层组成，从 内到外依次为：甘露糖，β-葡聚糖，壳聚糖，二酪氨酸。在本发明中，我们使 用一种酿酒酵母缺陷型菌株△dit1，此菌株产生的孢子壁不含最外的二酪氨酸 层，暴露在最外面的一层是壳聚糖，我们因此可以将酶直接固定在此缺陷型的 孢子上，得到孢子固定化酶。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较 佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或 省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略 不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法及 应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的 制备方法，以达到制备特定用途的固化酶的目的。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种以酿酒酵母孢子 为载体的新型固定化酶的制备方法，包括，酿酒酵母单菌落的培养，采用基因 同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SK1孢子壁最外层二酪氨酸层DIT1基 因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，28℃～32℃ 培养至长出单菌落；孢子的制备，挑取单菌落到YPAD液体培养基中，摇床培 养后，将菌液转接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，转到1％～3％的醋酸 钾溶液中培养，使得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2×10⁷/ml～4×10⁷/ml，而后 离心，将离心后的酿酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36℃～38℃下用一定量 的lyticase处理0.5h～1.5h后，进行超声波破碎，得到游离状态的酿酒酵母孢 子并对孢子进行纯化和冷冻干燥；酶的固定化，将β-半乳糖苷酶固定到酿酒酵 母DIT1基因缺陷型的孢子上。将经纯化的酿酒酵母△dit1孢子，用2％～3％的 戊二醛溶液进行处理，然后洗涤酿酒酵母孢子，向酿酒酵母孢子中加入配制好 的β-半乳糖苷酶溶液，在3℃～5℃下进行固定，离心，洗涤，得到固定化的β- 半乳糖苷酶。

作为本发明所述以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法的一 种优选方案，其中：所述酿酒酵母单菌落的培养，包括，

引物设计：依据酿酒酵母DIT1基因序列设计引物如下：

上游引物P1

AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACA AAACGGATCCCCGGGTTAATTAA

下游引物P2

TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACT TTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC；

PCR扩增，利用上游引物P1和下游引物P2对质粒pFA6a-His3MX6进行 PCR扩增，获得含酿酒酵母DIT1基因上下游序列的敲除片段；

DIT1基因的敲除，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的his 片段分别导入到酿酒酵母SK1得单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选；