[发明专利]细胞核移植有效
申请号: | 201310068569.7 | 申请日: | 2006-09-08 |
公开(公告)号: | CN103205463A | 公开(公告)日: | 2013-07-17 |
发明(设计)人: | 杜玉涛;G·瓦吉塔;L·A·伯朗德;P·M·克莱 | 申请(专利权)人: | 奥尔胡斯大学 |
主分类号: | C12N15/873 | 分类号: | C12N15/873;A01K67/027;A01N1/02;C12N5/10 |
代理公司: | 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 11038 | 代理人: | 陈轶兰 |
地址: | 丹麦奥*** | 国省代码: | 丹麦;DK |
权利要求书: | 查看更多 | 说明书: | 查看更多 |
摘要: | 本发明公开了细胞核移植的方法,其包括,例如对卵母细胞的透明带的修饰,和/或将卵母细胞分成几部分。本发明也公开了生产遗传修饰的非人类哺乳动物的方法。通过所公开的方法而得到的遗传修饰的非人类哺乳动物也在本发明的范围内。所公开的内容还有细胞的深低温保藏方法。 | ||
搜索关键词: | 细胞核 移植 | ||
【主权项】:
细胞核移植方法,其包括以下步骤:a.构建具有至少一部分经修饰的透明带的至少一个卵母细胞,b.将该卵母细胞分成至少2部分,从而获得至少一个细胞质体,c.构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核,d.将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合,e.得到重建的胚胎。
下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于奥尔胡斯大学,未经奥尔胡斯大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服】
本文链接:http://www.vipzhuanli.com/patent/201310068569.7/,转载请声明来源钻瓜专利网。
- 同类专利
- 一种高产奶牛卵裂球重构胚胎的制备方法-201810241051.1
- 张立苹;林郑云;郑新民;毕延震;刘西梅;肖红卫;华再东;华文君;曹辉 - 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
- 2018-03-22 - 2018-08-21 - C12N15/873
- 本发明公开了一种高产奶牛卵裂球重构胚胎的制备方法,属于胚胎学领域。本方法具体如下:1、制备体外成熟奶牛卵母细胞;2、解冻高产奶牛冷冻精子;3、制备32细胞期以上高产奶牛体外受精胚胎;4、采用piezo操作系统构建高产奶牛胚胎卵裂球重构胚胎;5、重构胚胎体外培养。本发明通过使用piezo操作系统制备高产奶牛胚胎卵裂球重构胚胎,取代现有技术中使用激光破膜仪或者斜口针制备重构胚胎的步骤,piezo操作系统将电压效应产生的脉冲经由显微注射针头直接作用于欲注射的细胞表面,大大减少了对胚胎的损伤,提高了重构胚胎的存活率。
- 一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法及其应用-201410021170.8
- 李宁;贺津;胡晓湘;赵要风;李秋艳;于政权 - 中国农业大学
- 2014-01-16 - 2017-12-26 - C12N15/873
- 本发明提供了一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法及应用,利用基因编辑技术在猪PKD1基因5号外显子处引入插入突变,敲除猪PKD1基因,构建了一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪模型。本发明建立的基因突变猪模型可用于常染色体显性多囊肾病的研究及药物筛选。
- 一种气动注射器的细胞抽核方法-201710421814.6
- 赵新;刘曜玮;孙明竹;崔茂盛;王雪锋;冯泽阳;李娜 - 南开大学
- 2017-06-07 - 2017-08-18 - C12N15/873
- 本发明提供了一种气动注射器的细胞抽核方法。该方法的特点是在抽核过程中,在微针的前端先吸入一段液体,再继续进行抽核。该方法包括通过气动注射器对抽核用的微针内部施加正压;将微针浸入操作液中,减小微针中的正压通过毛细作用抽取卵母细胞操作液到微针前端;将微针刺入细胞,减小微针中的正压,通过毛细作用实现细胞的抽核行为,进而实现了此种减小细胞损伤的抽核过程。
- 一种卵生动物的克隆方法-201610995980.2
- 李宁 - 李宁
- 2016-11-12 - 2017-05-03 - C12N15/873
- 本发明涉及一种卵生动物的克隆方法。通过一种简单设计,实现卵生动物的克隆,增加经济生物的产量与质量,保护稀有卵生动物,如鸟类,爬行类动物等。
- 构建灵长类动物miRNA-122敲除模型的方法、灵长类动物肝癌模型及用途-201410593647.X
- 席建忠;孙常宏 - 北京大学
- 2014-10-30 - 2016-06-01 - C12N15/873
- 构建灵长类动物肝癌模型的方法,包括以下步骤:a)将特异性靶向miR122的gRNA序列插入到适宜的载体中,构建出体外转录miR122的模板载体;b)将cas9基因的序列插入到适宜的载体中,构建出体外转录cas9基因的模板载体;c)以步骤a)中的载体为模板进行PCR扩增,得到体外转录miR122的gRNA的模板;d)用限制性内切酶将步骤b)中的模板载体线性化,得到体外转录cas9基因的模板;e)以步骤c)和d)中的产物为模板进行体外转录,得到特异性靶向miR122的gRNA和cas9基因的mRNA;f)将步骤e)中的gRNA和mRNA注射到所述动物的受精卵细胞中,或者注射到卵母细胞中,再与所述动物的精子进行体外受精得到受精卵细胞;g)将步骤f)中的受精卵细胞移植入所述动物的子宫中,由此产生稳定的敲除miR122的动物子代。
- 一种无选择标记的多基因复合性状基因工程猪的制备方法-201510697023.7
- 唐中林;李奎;周荣;刘志国;李素霞;杨亚岚 - 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
- 2015-10-22 - 2015-12-30 - C12N15/873
- 本发明涉及转基因猪领域,特别涉及一种无选择标记的多基因复合性状基因工程猪的制备方法,包括以下步骤:以携带有无选择标记的sFat-1-2A-Fad-2基因片段的成纤维细胞作为供体,去核的成熟的猪卵母细胞作为受体,采用体细胞核移植的方法获得含有无选择标记的多基因复合性状基因的重构胚胎;进行体外培养后,移植到代孕的猪体内,猪分娩后,即得到无选择标记的多基因复合性状基因工程猪。该方法是将无选择标记的基因采取体细胞核移植的方法制备sFat1-2A-Fad2转基因猪,获得富含n-3不饱和脂肪的转基因猪,从而加快猪的肉质改良速度;并且转入的基因不带有选择标记基因,避免了选择标记基因带来的潜在危害。
- 一种体细胞核移植重构胚融合电极-201520234850.8
- 孙永刚;李瑞哲;徐惊涛;韩银仓 - 青海省畜牧兽医科学院
- 2015-04-13 - 2015-08-26 - C12N15/873
- 本实用新型公开了一种体细胞核移植重构胚融合电极,它涉及哺乳动物育种及动物繁殖技术领域。它包括电极绝缘杆、电极电源连接端、电极固定端、不锈钢电极和电极融合端,电极绝缘杆的前端通过电极固定端固定有不锈钢电极,不锈钢电极的前端为电极融合端,不锈钢电极的后端为电极电源连接端,电极电源连接端位于电极绝缘杆中空18mm处,电极绝缘杆的后端固定在显微操作仪上。本实用新型简化重构胚融合的难度,提高了融合效率,对于提高体细胞核移植效率有重要意义。
- 利用过表达HOXA10基因制备转基因猪的方法-201410855615.2
- 赵书红;肖倩;赵长志;林瑞意;经璐;李新云;李长春;余梅;成宏 - 华中农业大学
- 2014-12-30 - 2015-04-22 - C12N15/873
- 本发明属于猪的转基因技术领域,具体涉及一种利用过表达HOXA10基因制备转基因猪的方法。本发明的特征在于,将构建的HOXA10基因表达载体通过脂质体转染和硫酸盐(G418)筛选得到稳定表达的转HOXA10基因的细胞系;以转HOXA10基因的猪成纤维细胞为核供体通过人工核移植的方法移入去核的猪的卵母细胞中形成重构胚;将重构胚胎移植入受体母猪输卵管中,待母猪生产获得转HOXA10基因猪并进行分子鉴定,筛选出阳性转HOXA10基因猪。本发明的转基因猪不仅为研究HOXA10基因提高繁殖力的机理提供素材,也为揭示猪HOXA10基因其他功能提供了动物模型。
- IRTKS基因剔除的小鼠模型及其构建方法与应用-201310267704.0
- 韩泽广;黄丽钰 - 上海人类基因组研究中心
- 2013-06-28 - 2014-12-31 - C12N15/873
- 本发明公开了一种IRTKS基因剔除的小鼠模型的构建方法,该方法通过同源重组,用2.0-kb PGK/Neo序列取代小鼠IRTKS基因中含有ATG起始密码子的exon1序列,得到IRTKS基因剔除的小鼠模型。本发明还公开了利用上述方法构建的IRTKS基因剔除的小鼠模型及其在糖尿病研究中的应用。通过病理分析及糖、胰岛素等检测证实IRTKS基因剔除后的小鼠会出现高血糖、高胰岛素、糖耐量降低、胰岛素敏感性降低等,与人类的发病特征相符,从而为糖尿病发病机制的研究以及治疗药物的评价和筛选提供了良好的动物模型。
- 一种基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法-201310232306.5
- 张涌;苏建民;王勇胜;刘军 - 西北农林科技大学;杨凌科元克隆股份有限公司
- 2013-06-09 - 2013-09-18 - C12N15/873
- 本发明公开了一种基于囊胚上基因表达水平筛选供体细胞系的方法,将来源不同个体的供体细胞系进行核移植后,在囊胚期检测TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R的表达水平,选择在克隆囊胚上这些基因的表达水平全部与正常发育的体外受精囊胚上的表达水平差异不显著的供体细胞系为核供体细胞,可显著提高牛体细胞克隆效率。
- 细胞核移植-201310068569.7
- 杜玉涛;G·瓦吉塔;L·A·伯朗德;P·M·克莱 - 奥尔胡斯大学
- 2006-09-08 - 2013-07-17 - C12N15/873
- 本发明公开了细胞核移植的方法,其包括,例如对卵母细胞的透明带的修饰,和/或将卵母细胞分成几部分。本发明也公开了生产遗传修饰的非人类哺乳动物的方法。通过所公开的方法而得到的遗传修饰的非人类哺乳动物也在本发明的范围内。所公开的内容还有细胞的深低温保藏方法。
- 一种以宽内径持卵管去除哺乳动物卵母细胞核的方法-201110268922.7
- 谌兵来;高擎;曾桥 - 谌兵来;高擎;曾桥
- 2011-09-13 - 2013-03-27 - C12N15/873
- 本发明提供了一种以宽内径持卵管去除哺乳动物卵母细胞核的方法,该方法采用宽内径(内径相当于卵母细胞直径1/5~1/4)持卵管吸持卵母细胞,辅助孵化针在第一极体处切开透明带,宽内径持卵管水平对准透明带裂隙加负压吸出第一极体和1/10~1/8的胞浆,辅助孵化针拨动或转动卵母细胞,使吸出的带核胞浆部分与卵母细胞脱离。本发明中持卵管同时起到了持卵和吸去核的作用,操作简便,减少了去核步骤,缩短了去核操作时间,提高了去核成功率,减少了卵母细胞的损害,有利于后续核移植过程中胚胎的发育。
- 一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法-201110218955.0
- 易建明;赵玲玲;宋海泉;杨利国;陶林林 - 华中农业大学
- 2011-07-30 - 2013-01-30 - C12N15/873
- 本发明涉及动物生殖和分子生物学操作技术领域。具体涉及牛体细胞核移植中供体细胞的选择方法。公开了一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法。为了提高牛核移植效率中的供体细胞的数量,本发明利用活体采样,接种法培养细胞,稳定传代的活力为OD值为0.609±0.053的第六代细胞,用浓度为100μmol/L的β-巯基乙醇处理细胞24h后的细胞作为供体细胞,为重构胚更好的发育奠定了基础。
- 一种体细胞核移植中的电融合方法-201210419705.8
- 吴珍芳;周荣;石俊松 - 广东温氏食品集团有限公司
- 2012-10-27 - 2013-01-16 - C12N15/873
- 本发明公开了一种体细胞核移植中的电融合方法,包括以下步骤:S1、将恢复后的重构卵分批转移到融合液中平衡;S2、用融合激活液洗涤重构卵;S3、将洗涤后的重构卵放入装有融合液的融合槽内,调整供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行并使供体细胞一端朝向电极的负极,用融合仪施加直流电脉冲诱导融合同时激活重构卵;S4、将融合激活后的重构卵用胚胎培养液洗涤,然后转入培养箱中,在矿物油覆盖的胚胎培养液中或辅助激活液中融合;该方法在融合的过程中,将供体细胞一端朝向电极的负极,提高了融合效率。
- 一种动物体细胞核移植中的融合方法-201210194403.5
- 吴珍芳;周荣;周秀;罗绿花;石俊松 - 广东温氏食品集团有限公司
- 2012-06-10 - 2012-10-03 - C12N15/873
- 本发明公开了一种动物体细胞核移植中的融合方法,包括以下步骤:(1)将两枚半卵细胞放入植物凝集素浓度为0.5-5mg/ml的操作液中粘合形成卵-卵细胞对;(2)将粘合好的卵-卵细胞对放入融合液中平衡1-3分钟;(3)将平衡后的卵-卵细胞对放入电融合槽中电融合,并施加交流场对卵-卵细胞对进行瞬间定位;(4)将融合好的卵-卵细胞对移入含有供体细胞的操作液中与供体细胞粘合形成体-卵细胞;(5)将粘合好的体-卵细胞移入融合激发液中平衡1-3分钟,再移入到融合槽中进行电融合同时激活。本发明所采用的方法先将两个半卵细胞融合,再将融合后的卵-卵细胞与供体细胞融合,增大卵细胞与供体细胞的接触面积,操作上更加简单。
- 抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的制备方法-201110349774.1
- 何洪彬;王洪梅;刘晓;武建明;杨宏军;宋玲玲;高运东;侯明海;武刚;仲跻峰 - 山东省农业科学院奶牛研究中心
- 2011-11-08 - 2012-07-11 - C12N15/873
- 本发明公开了一种通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法:是将携带shRNA碱基序列及GFP报告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重组Lenti-virus载体线性化并转染正常家畜的胎儿成纤维细胞,利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪筛分转基因核供体细胞,将核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚,再将重构胚移入代孕家畜子宫中,得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配或人工授精繁殖即获得纯合子转基因家畜。用本方法获得的转基因家畜可表达抗口蹄疫病毒RNAi,使FMDV感染率明显下降,具备了抗FMD的能力。
- 自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型及其制备方法-201110437691.8
- 陆国平;陈桢玥 - 上海交通大学医学院附属瑞金医院
- 2011-12-23 - 2012-06-27 - C12N15/873
- 本发明公开了一种apoE和Mthfr双重基因缺陷的高同型半胱氨酸血症相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型及其制备方法,该动物模型更好地结合了两种基因缺失模型的特性,既可使其能够自发形成HHcy血症并发展为动脉粥样硬化,又最大程度地避免了除HHcy以外其他致动脉粥样硬化因素的作用。该动物模型重复性高、可控性好,易于饲养繁殖,弥补了现有动物模型的不足,且更稳定、更符合临床特点,为HHcy相关动脉粥样硬化的发生机制研究及干预措施的探索提供了更好的平台。
- 用于克隆技术的细胞核物质获取法-201010281473.5
- 陈子江;吴克良;马金龙 - 山东大学;山东山大附属生殖医院有限公司
- 2010-09-13 - 2012-04-04 - C12N15/873
- 本发明属于生物技术领域,涉及一种获取细胞核物质的方法,包括步骤:(1)用激光在细胞卵周隙较大的透明带部分打孔;(2)用持卵针固定住细胞,使透明带开口端位于与持卵针相对的位置;(3)用吸有液体的注射针从透明带开口处扎入胞浆中,并避免直接接触到核物质;(4)迅速增加注射针中的正压使针中的液体向外快速流动,以冲断核物质与胞浆之间的连接,使核物质周围无任何胞质部分,并利用整个细胞内正压的提高来使得核物质完整的从透明带开口处被压离细胞;(5)用注射针收集分离的核物质。本发明的获取核物质的方法不需要特殊仪器,可以方便简单地分离核物质,避免核物质破裂,获得的核物质便于进行细胞融合实验。
- 一种siRNA 转染哺乳类动物胚胎的电穿孔方法-201110300097.4
- 常博皞;张涌;彭辉;苏建民 - 西北农林科技大学;杨凌科元克隆股份有限公司
- 2011-09-27 - 2012-01-25 - C12N15/873
- 本发明公开了一种siRNA转染胚胎的电穿孔方法,包括以下步骤:1)对胚胎透明带进行弱化处理;2)配制含siRNA的电穿孔溶液;3)将胚胎移入配制好的含siRNA的电穿孔溶液,室温静置,然后再将胚胎连同电穿孔溶液移入电转槽中进行电穿孔。本发明包括对胚胎的透明带的弱化处理和siRNA的络合处理,然后通过将胚胎置于脉冲电场作用下,导致其通透性和膜电导瞬时增大,使在正常生理情况下细胞膜难以通透的siRNA进入细胞。统计学观察分析表明,本发明存活胚胎稳定阳性转染率超过95%,采集的总胚胎实际有效利用率超过70%,是一种安全、简便、高效的siRNA转染哺乳类动物胚胎的技术。
- 一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法-201110185317.3
- 石德顺;陆凤花;罗婵;李楠;韦英明;刘庆友;李湘萍;蒋建荣 - 广西大学
- 2011-07-04 - 2011-11-23 - C12N15/873
- 一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法,是从水牛胎儿分离培养得到水牛胎儿成纤维(BFF),再将携带新霉素抗性基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的转基因载体(pCE-EGFP-IRES-neo)通过电穿孔法导入BFF,并通过G418筛选获得转EGFP基因的BFF;而后,将转EGFP基因的BFF移植到去核的水牛卵母细胞构建克隆重构胚,经5μmol/L离子霉素处理5min,再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培养3h进行化学激活处理后,置于颗粒细胞单层共培养6-7d后获得转基因克隆囊胚。在倒置荧光显微镜下挑选表达EGFP的转基因克隆囊胚移植到受体水牛,经过妊娠足月后分娩获得转基因克隆犊牛。经紫外灯照射,这些转基因克隆水牛犊头部和四肢明显均表达EGFP标记基因,证明用本发明的方法可成功生产转基因克隆水牛。
- 一种利用显微授精技术生产转基因兔的方法-201110093587.1
- 陆凤花;石德顺;张顺;刘庆友;罗婵;李湘萍 - 广西大学
- 2011-04-14 - 2011-11-16 - C12N15/873
- 一种利用显微授精技术生产转基因兔的方法,通过假阴道法采集精液或从附睾收集的精液用PBS上游,经离心洗涤后,分装到冷冻管中,投入液氮中保存;进行显微操作之前,从液氮中取出装有精子的冷冻管,室温下解冻,加入外源DNA质粒与冻融的精子充分混匀,使DNA质粒的终浓度为30ng/ul,并置于4℃下孵育10分钟,使精子与DNA充分结合,然后,通过显微授精技术,将孵育了DNA的精子注入到兔卵母细胞胞质中,显微授精后的卵母细胞经过化学激活处理后,放入培养滴中培养2-4天。用本发明的方法,成功生产了转基因兔胚胎,胚胎阳性率达到59.65%,经胚胎移植获得母兔妊娠并产下活仔兔,仔兔经过细胞和分子生物学鉴定,证明4只表达有外源基因转基因兔,阳性率为57.14%。
- 慢病毒感染胚胎的方法-200910237357.0
- 田见晖;苗凯;郭敏;吴中红;王晓英;王超 - 中国农业大学
- 2009-11-10 - 2010-06-02 - C12N15/873
- 本发明提供了一种慢病毒感染胚胎的方法,其是在胚胎2细胞期时,将慢病毒悬液注入至胚胎卵周隙。研究表明2细胞期Piezo注射组较之1细胞期注射可以明显获得较高的胚胎成活率、胚胎发育率和阳性胚胎率。本发明方法效率高、成本低,适合在实验研究以及胚胎工程中广泛推广使用。
- 专利分类