[发明专利]基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及检测轮状病毒的试剂盒。首先根据食源性病毒的保守性序设计助引物、荧光染料标记引物和磁性引物，通过PCR反应得到带有荧光染料的PCR产物的磁珠，然后用流式细胞仪检测带有荧光染料的PCR产物的磁珠的荧光信号即可确定样品中食源性病毒的种类。当检测体系里存在目标DNA或cDNA时，随着PCR过程的进行，磁珠上便直接带有荧光染料的PCR产物；当没有目标DNA或cDNA存在时，磁性引物不会发生扩增，因而不会出现带有荧光染料的磁珠，之后再通过磁分离和流式细胞术完成检测。该方法灵敏度高、特异性好、操作简便、检测时间短，具有很强的推广性和实用性。

主权项

一种基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）模板的准备：提取食源性病毒的DNA或RNA；对于RNA，需逆转录得到cDNA；（2）设计合成用于扩增食源性病毒保守序列的引物：①磁珠连接引物：5’‑3’方向依次为用于与磁珠反应的功能基团、用于隔开磁珠和核心序列的联结链和核心序列，核心序列根据模板序列设计得到；②助引物：为磁珠连接引物中的核心序列；③荧光标记引物：根据模板序列设计得到、且能与助引物进行PCR扩增得到食源性病毒保守序列的引物，其5’端标记有荧光染料；（3）制备磁性引物：将步骤（2）中的磁珠连接引物与功能化磁珠反应得到磁性引物；（4）PCR反应：将步骤（1）制备的模板，步骤（2）设计合成的荧光标记引物、助引物和步骤（3）制备的磁性引物进行PCR扩增反应，得到PCR产物；（5）分离纯化：将步骤（4）所得的PCR产物进行分离纯化，得到带有荧光染料的PCR产物的磁珠；（6）检测：对步骤（5）所得的带有荧光染料的PCR产物的磁珠用流式细胞仪检测荧光信号，荧光信号值高于阈值即表明样品中含有食源性病毒，根据引物的种类即可判断样品中食源性病毒的种类。