[发明专利]基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）模板的准备：提取食源性病毒的DNA或RNA；对于RNA，需逆转录得到cDNA；

（2）设计合成用于扩增食源性病毒保守序列的引物：①磁珠连接引物：5’-3’方向依次为用于与磁珠反应的功能基团、用于隔开磁珠和核心序列的联结链和核心序列，核心序列根据模板序列设计得到；②助引物：为磁珠连接引物中的核心序列；③荧光标记引物：根据模板序列设计得到、且能与助引物进行PCR扩增得到食源性病毒保守序列的引物，其5’端标记有荧光染料；

（3）制备磁性引物：将步骤（2）中的磁珠连接引物与功能化磁珠反应得到磁性引物；

（4）PCR反应：将步骤（1）制备的模板，步骤（2）设计合成的荧光标记引物、助引物和步骤（3）制备的磁性引物进行PCR扩增反应，得到PCR产物；

（5）分离纯化：将步骤（4）所得的PCR产物进行分离纯化，得到带有荧光染料的PCR产物的磁珠；

（6）检测：对步骤（5）所得的带有荧光染料的PCR产物的磁珠用流式细胞仪检测荧光信号，荧光信号值高于阈值即表明样品中含有食源性病毒，根据引物的种类即可判断样品中食源性病毒的种类。

2.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的食源性病毒保守序列为食源性病毒特异基因的保守序列；

步骤（2）中所述的用于与磁珠反应的功能基团为氨基、羧基、磷酸基、生物素、链霉亲和素、羟基或巯基；

步骤（2）中所述的联结链为不影响PCR反应特异性的随机DNA序列；

步骤（2）中所述的荧光染料为FAM、FITC、Cy5或Alexa Fluor 488。

3.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的功能化磁珠的粒径为20nm～10μm；

步骤（3）中所述的功能化磁珠为表面修饰有功能基团的磁珠，所述的功能基团为氨基、羧基或巯基；

步骤（3）中所述的磁性引物的制备方法为：将磁珠连接引物与处理后的功能化磁珠在连接反应液中孵育，纯化，得到磁性引物；其中，磁珠连接引物与磁珠按2～20nmol/mg配比；所述的处理的方式为先用0.01M氢氧化钠溶液清洗功能化磁珠，再用去离子水冲洗；所述的连接反应液为：0.1M的2-吗啉乙磺酸，体积百分比0.25%的吐温-20，10mM的碳二亚胺盐酸盐，pH值为5.0；所述的孵育的条件为室温条件反应3～5小时；所述的纯化为通过磁分离器分离磁性引物，并用纯化缓冲液清洗，所述的纯化缓冲液为：10mM、pH 7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%。

4.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的PCR反应的体系包含：模板、Taq酶、Taq酶缓冲液、dNTP、磁性引物、助引物、荧光标记引物、TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白；所述的磁性引物的终浓度为0.1～0.3μg/μL；所述的助引物的终浓度为20～60nM，所述的荧光标记引物的终浓度为300～500nM，助引物与荧光标记引物按摩尔比1:5～1:25配比；所述的TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白的终浓度分别为体积百分比0.1%、体积百分比0.5%和质量百分比0.05%。

5.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的分离纯化为通过磁分离器进行分离，并用纯化缓冲液清洗；所述的纯化缓冲液为：10mM、pH 7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%。

6.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：步骤（6）中所述的检测的方法为：将步骤（5）得到的磁珠用检测缓冲液冲洗，然后用检测缓冲液重悬磁珠，再转入流式细胞仪进行检测；所述的检测缓冲液为：1倍Taq酶缓冲液中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%。