[发明专利]基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及试剂盒。 

背景技术

食品安全是国家和人民密切关注的话题，食品安全问题会导致全球范围内的食源性疾病。食源性病毒是食源性疾病的重要病原，是引起食品安全事件的主要致病因子之一。食源性病毒主要有甲型病毒、禽流感病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒、腺病毒等。调查发现，至少40%的生物性食物中毒病例是食源性病毒引起的。各国由食源性病毒引起的疫情屡见不鲜。自2011年11月以来，日本厚生劳动所确认由诺瓦克病毒引致的食物中毒事件共有213件、病人9650人，中毒人数已经大大超过历史上最为严重的2004年。2012年2月，马来西亚爆发轮状病毒疫情，造成2名儿童死亡，三千多人染病。近年来，由H5N1亚型禽流感病毒引起的疫情广泛传播对人类的健康造成全球性的重大威胁，中国以及其他国家都不断爆发禽流感疫情。食源性病毒一直难以得到及时有效的监控，不仅对食品卫生和人民健康构成严重威胁，也对食品工业和国民经济造成很大的影响。因此，发展一种快速，灵敏，特异，安全的检测食源性病毒的方法对食品安全体系的完善、预防人类食源性病毒病的发生具有重要意义。 

传统的食源性病毒的检测方法主要有细胞培养、电子显微镜观察法、免疫学检测方法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。细胞培养法的操作烦琐，需时较长，一般需要一周才能观察到细胞病理反应，另外许多肠道食源性病毒不能进行细胞培养，而其他方法具有灵敏度低、特异性不高、耗时长、需要昂贵仪器等缺点。 

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术，具有速度快、精度高、准确性好等特点。流式细胞仪被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。 

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于磁性引物扩增与流式细胞术结合的快速、高灵敏度、准确、操作简便的检测食源性病毒的方法。 

本发明的另一目的在于提供一种使用上述方法实现检测轮状病毒的试剂盒。 

本发明的目的通过下述技术方案实现，基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，具体包括以下步骤： 

（1）模板的准备：提取食源性病毒的DNA或RNA；对于RNA，需逆转录得到cDNA； 

（2）设计合成用于扩增食源性病毒保守序列的引物：①磁珠连接引物：5’-3’方向依次为用于与磁珠反应的功能基团、用于隔开磁珠和核心序列的联结链（linker）和核心序列，核心序列根据模板序列设计得到；②助引物：为磁珠连接引物中的核心序列；③荧光标记引物：根据模板序列设计得到、且能与助引物进行PCR扩增得到食源性病毒保守序列的引物，其5’端标记有荧光染料； 

（3）制备磁性引物：将步骤（2）中的磁珠连接引物与功能化磁珠反应得到磁性引物； 

（4）PCR反应：将步骤（1）制备的模板，步骤（2）设计合成的荧光标记引物、助引物和步骤（3）制备的磁性引物进行PCR扩增反应，得到PCR产物； 

（5）分离纯化：将步骤（4）所得的PCR产物进行分离纯化，得到带有荧光染料的PCR产物的磁珠； 

（6）检测：对步骤（5）所得的带有荧光染料的PCR产物的磁珠用流式细胞仪检测荧光信号，荧光信号值高于阈值（阈值为3组以上阴性对照样品的平均光信号值加上其3倍标准偏差）即表明样品中含有食源性病毒，根据引物的种类即可判断样品中食源性病毒的种类。 

由于本方法不需要再孵育等步骤，另外流式细胞仪本身具有操作简便快速的特点，因此可以实现样品的快速检测。 

步骤（1）中所述的食源性病毒包括轮状病毒（rotavirus，双链RNA病毒）、诺瓦克病毒（norovirus，单链RNA病毒）、腺病毒（adenovirus，双链DNA病毒）、禽流感病毒（avian influenza virus，单链RNA病毒）、星状病毒（astroviridae，单链RNA病毒）、甲肝病毒（hapatitis A virus，单链RNA病毒）和脊髓灰质炎病毒（poliovirus，单链RNA病毒）等病毒；