[发明专利]R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法

摘要

本发明公开一种R-邻氯扁桃酸及其醇酯制备方法。本方法通过诱导表达重组S-扁桃酸脱氢酶、羰基还原酶及葡萄糖脱氢酶，以外消旋型邻氯扁桃酸或其醇酯及葡萄糖为底物，进行顺序催化反应，获得R-邻氯扁桃酸或其醇酯。采用的基因工程菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌及酿酒酵母。该方法是一种环境友好、经济的R-邻氯扁桃酸单一光学对映体制备方法，反应时间短，耗能小，易于操作，得率高，产物R-邻氯扁桃酸（或其醇酯）的得率大于85%，R-邻氯扁桃酸（或其醇酯）的ee值在95%以上。本发明将廉价易得的外消旋型邻氯扁桃酸生物催化为具有重要工业价值的R-邻氯扁桃酸，成本低，绿色环保，工艺简化，适于工业化生产。

主权项

1.一种R-邻氯扁桃酸的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）酶的重组表达设计引物对P1、P2：P1：5’-atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2：5’-gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3’，以荧光假单胞菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第一次扩增，扩增产物为S-扁桃酸脱氢酶基因PfMdlB，经改造后得到序列为Seq1的氨基酸，将序列Seq1与表达载体pETDuet-1连接；设计引物对P3、P4：P3：5’-ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3’，P4：5’-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，以枯草芽孢杆菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第二次扩增，扩增产物为枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因BsGDH，其氨基酸序列为Seq2N；设计引物对P5、P6：P5：5’-gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3’，P6：5’-gggccgctcgagttatattctgccctcaaat3’， 以酿酒酵母基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第三次扩增，扩增产物为酿酒酵母羰基还原酶基因GRE2，经改造后得到序列为Seq3的氨基酸，将Seq2N、Seq3先后与表达载体pETDuet-1连接；（2）转化宿主  制备BL21宿主感受态后，通过热激法或电击法获得能够表达S-扁桃酸脱氢酶的基因工程菌及可表达GRE2与BsGDH的基因工程菌，备用；（3）接种培养  将所述基因工程菌和基因工程菌按菌体密度1~5:1的比例混合，共同培养于LB-Amp液体培养基中，于37℃摇床振荡培养6~10h，转速240转/分，当OD₆₀₀达到 0.4~0.6时，接种于装有150mL LB-Amp液体培养基的三角瓶中，三角瓶用纱布封口，继续培养至OD₆₀₀ 0.4~0.6，将所有培养物接种于装有10L LB-Amp液体培养基的种子罐中，培养8h，移种至150L发酵罐中，培养至OD₆₀₀ 0.4~0.5，于23℃~26℃、摇床振荡培养5~8h，转速220转/分，至DO值25%~38%；（4）外消旋型邻氯扁桃酸和葡萄糖的添加：按照1mol/L的浓度添加外消旋型邻氯扁桃酸，葡萄糖添加量为外消旋型扁桃酸的1-1.5倍，以NADP为辅因子，经过6~10h催化，获得R-邻氯扁桃酸。