[发明专利]R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法

权利要求书

1.一种R-邻氯扁桃酸的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）酶的重组表达

设计引物对P1、P2：

P1：5’-atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2：5’-gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3’，

以荧光假单胞菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第一次扩增，扩增产物为S-扁桃酸脱氢酶基因PfMdlB，经改造后得到序列为Seq1的氨基酸，将序列Seq1与表达载体pETDuet-1连接；

设计引物对P3、P4：

P3：5’-ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3’，P4：5’-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，

以枯草芽孢杆菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第二次扩增，扩增产物为枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因BsGDH，其氨基酸序列为Seq2N；

设计引物对P5、P6：

P5：5’-gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3’，P6：5’-gggccgctcgagttatattctgccctcaaat3’， 

以酿酒酵母基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第三次扩增，扩增产物为酿酒酵母羰基还原酶基因GRE2，经改造后得到序列为Seq3的氨基酸，将Seq2N、Seq3先后与表达载体pETDuet-1连接；

（2）转化宿主  制备BL21宿主感受态后，通过热激法或电击法获得能够表达S-扁桃酸脱氢酶的基因工程菌                                                   及可表达GRE2与BsGDH的基因工程菌   ，备用；

（3）接种培养  将所述基因工程菌   和基因工程菌   按菌体密度1~5:1的比例混合，共同培养于LB-Amp液体培养基中，于37℃摇床振荡培养6~10h，转速240转/分，当OD₆₀₀达到 0.4~0.6时，接种于装有150mL LB-Amp液体培养基的三角瓶中，三角瓶用纱布封口，继续培养至OD₆₀₀ 0.4~0.6，将所有培养物接种于装有10L LB-Amp液体培养基的种子罐中，培养8h，移种至150L发酵罐中，培养至OD₆₀₀ 0.4~0.5，于23℃~26℃、摇床振荡培养5~8h，转速220转/分，至DO值25%~38%；

（4）外消旋型邻氯扁桃酸和葡萄糖的添加：按照1mol/L的浓度添加外消旋型邻氯扁桃酸，葡萄糖添加量

为外消旋型扁桃酸的1-1.5倍，以NADP为辅因子，经过6~10h催化，获得R-邻氯扁桃酸。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：其中第一次、第二次和第三次PCR扩增时PCR体系

均为：10×Taq buffer 5μl；10 mmol/L 的dNTP 1.5μl；25 mmol/L MgCl₂ 3μl；对应的上下游引物各1μl；DNA模板1μl；5U/μl Taq DNA 聚合酶0.25μl；ddH₂O 37.25μl。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：其中第一次PCR扩增时的步骤为：

(1) 95℃，预变性3min；(2) 94℃，变性30s；(3) 50℃退火30s；(4) 72℃延伸75s；步骤(2)～(4) 重复 30

次；(5) 72℃继续延伸10min，冷却至4 ℃。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：其中第二次PCR扩增时的步骤为：(1) 94℃，预变性

3min；(2) 94℃，变性30s；(3) 54℃退火30s； (4) 72℃延伸50s；步骤(2)～(4)重复30次；(5) 72℃继续延伸10min，冷却至4℃。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：其中第三次PCR扩增时的步骤为： (1) 94℃，预变性3min；(2) 94℃，变性30s；(3) 54℃退火30s；(4) 72℃延伸66s；步骤(2)～(4)重复30次；(5) 72℃继续延伸10min，冷却至4℃。