[发明专利]R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种邻氯扁桃酸及其醇酯，特别是涉及一种R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法。 

背景技术

邻氯扁桃酸或其醇酯是一种重要的医药、化工中间体。单一对映体R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备依赖于三类方法：化学法、物理法和生物法。（1）化学法，主要是利用手性胺类化合物，通过形成非对映异构体盐，得到单一对映体，也可以利用某种还原试剂以邻氯苯乙酮酸甲酯不对称合成单一构型的扁桃酸甲酯。（2）物理法，用于邻氯扁桃酸或其醇酯的对映体拆分，如色谱法、结晶法、膜法和超临界萃取等方法。无论化学法还是物理法邻氯扁桃酸或其醇酯对映体的拆分，都不可避免地带来环保及成本压力、重金属残留等弊端。近年来生物法发展较为迅速，生物法国内外的研究逐年增多，包括野生微生物转化、基因工程菌转化、酶法催化及反应介质的选择等诸多报道。其中，野生微生物转化主要是以外消旋型邻氯扁桃酸或其醇酯为底物，通过特定微生物降解某一对映体，获得单一光学对映体邻氯扁桃酸或其醇酯，即便经过菌种改造提高转化速率，这种方法最大转化率的理论值仅为50%，转化率较低，造成资源浪费。 

国际上，通过定向进化技术获得的羟氰化酶已应用于R-邻氯扁桃酸的工业生产。但由于反应中有剧毒物质HCN的参与，存在极大的安全隐患及环境压力。采用专一性羰基还原酶还原邻氯苯乙酮酸甲酯，进而通过分离纯化获得单一的R-邻氯扁桃酸甲酯，但这种方法需要添加特定的辅因子NADP⁺（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸），使得反应向还原方向持续进行，成本较高，而且上述方法往往需要调节转化反应体系，比如常采用两相催化及离子液体等反应体系，以期获得更高的产率及光学纯度，生产过程较复杂。 

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有技术存在的缺陷，提供一种底物廉价易得、理论转化率高、环境友好、经济的R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法。 

本发明的技术方案： 

本发明提供一种R-邻氯扁桃酸及其醇酯制备方法，构建一种氧化还原偶联催化体系，该体系包括工程菌培养，诱导表达S-扁桃酸脱氢酶、邻氯苯乙酮酸羰基还原酶及葡萄糖脱氢酶，直接制备静息细胞-磷酸盐缓冲体系，以外消旋型邻氯扁桃酸（或其醇酯）及葡萄糖为底物，进行顺序催化反应。

R-邻氯扁桃酸的制备方法包括以下步骤： 

（1）酶的重组表达

设计引物对P1、P2：

P1：5’-atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2：5’-gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3’，

以荧光假单胞菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第一次扩增，扩增产物为S-扁桃酸脱氢酶基因PfMdlB，经改造后得到序列为Seq1的氨基酸，将序列Seq1与表达载体pETDuet-1连接；

设计引物对P3、P4：

P3：5’-ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3’，P4：5’-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，

以枯草芽孢杆菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第二次扩增，扩增产物为枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因BsGDH，其氨基酸序列为Seq2N；

设计引物对P5、P6：

P5：5’-gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3’，P6：5’-gggccgctcgagttatattctgccctcaaat3’， 

以酿酒酵母基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第三次扩增，扩增产物为酿酒酵母羰基还原酶基因GRE2，经改造后得到序列为Seq3的氨基酸，将Seq2N、Seq3先后与表达载体pETDuet-1连接；

（2）转化宿主  制备BL21宿主感受态后，通过热激法或电击法获得能够表达S-扁桃酸脱氢酶的基因工程菌 及可表达GRE2与BsGDH的基因工程菌 ，备用；