[发明专利]基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法

摘要

本发明涉及一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，属生物高技术领域。本发明将微卫星引物标记荧光(5′-FAM)，再进行PCR扩增，使PCR产物带有5′-FAM荧光标记。将PCR产物与分子内标混合，经DNA全自动测序仪的扫描检测后，通过不同等位基因扩增片段与分子内标的相对位置而识别出目的片段的长度大小，达到基因分型的目的。通过计算杂合度及各项法医学鉴定指数，能对个体识别和群体多样性、品系纯度评估。本发明也能够通过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，依据不同大小的等位基因片段判别不同基因型。本发明具有简单、快速、灵敏和适用的特点，对于树鼩资源遗传多样性评估、品种品系的分子标记辅助选育和个体识别具有重要意义。

主权项

1.一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：A、使用酚/氯仿法或试剂盒提取法从树鼩组织或血液中提取基因组DNA；B、以步骤A提取的基因组DNA为模板，扩增各微卫星位点的各个上游引物标记5′-FAM，进行PCR反应；PCR反应引物和扩增条件如下：a：PCR反应体系中含10％DMSO；b：51.2指以51.2度为退火温度，35次循环；c：64～60℃-1/cycle58∶27cycles为初始的几个循环是以64度为退火温度，每一循环退火温度降一度，再以58度为退火温度度循环27次PCR反应体系：总体系为20μL，包含50ng基因组DNA，pH为8.3的10mMTris-HCl，1.0-1.8mM MgCl₂，50mM KCl，0.5U TaKaRa rTaq，200μM dNTP，上游和下游引物各0.2μM；PCR反应程序：94℃，预变性5min；94℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸5min；不同的微卫星位点具有不同的反应程序，具体见上表；C、PCR产物检测：取PCR产物2μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，150V恒压电泳15min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照；D、样品上样前准备：按照琼脂糖凝胶检测的结果，将PCR产物稀释至1ng/μL，取1μL稀释后PCR产物，加入到含有GeneScan^TM-500和Hi-DiTM Formamide的9μL混合液中，充分混匀；95℃预变性5min后迅速置于冰上；E、上样检测：将处理后的样品分别上样到ABI PRISM 3730型或其他型号DNA全自动测序仪进行扫描检测；F、数据读取：使用Genemarker V1.6或Genemapper软件判读基因型；G、在没有荧光标定和检测条件下，对上述步骤A至B，采用各微卫星引物对按照上述PCR扩增条件直接扩增基因组DNA，通过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，依据电泳胶上不同等位基因片段大小的不同，判别出不同基因型；H、数据分析：使用POPgene 1.32或POPGENE软件计算树鼩微卫星等位基因频率，种群杂合度；用PowerStats V1.2软件计算多态信息含量，个体识别率，非父排除率，亲权指数；用Cervus 3.0软件计算无效等位基因频率，相似率，同胞相似率、及亲权鉴定有关的指标。