[发明专利]基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法

权利要求书

1.一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

A、使用酚/氯仿法或试剂盒提取法从树鼩组织或血液中提取基因组DNA；

B、以步骤A提取的基因组DNA为模板，扩增各微卫星位点的各个上游引物标记5′-FAM，进行PCR反应；PCR反应引物和扩增条件如下：

a：PCR反应体系中含10％DMSO；b：51.2指以51.2度为退火温度，35次循环；c：64～60℃-1/cycle58∶27cycles为初始的几个循环是以64度为退火温度，每一循环退火温度降一度，再以58度为退火温度度循环27次

PCR反应体系：总体系为20μL，包含50ng基因组DNA，pH为8.3的10mMTris-HCl，1.0-1.8mM MgCl₂，50mM KCl，0.5U TaKaRa rTaq，200μM dNTP，上游和下游引物各0.2μM；

PCR反应程序：94℃，预变性5min；94℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸5min；不同的微卫星位点具有不同的反应程序，具体见上表；

C、PCR产物检测：取PCR产物2μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，150V恒压电泳15min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照；

D、样品上样前准备：按照琼脂糖凝胶检测的结果，将PCR产物稀释至1ng/μL，取1μL稀释后PCR产物，加入到含有GeneScan^TM-500和Hi-DiTM Formamide的9μL混合液中，充分混匀；95℃预变性5min后迅速置于冰上；

E、上样检测：将处理后的样品分别上样到ABI PRISM 3730型或其他型号DNA全自动测序仪进行扫描检测；

F、数据读取：使用Genemarker V1.6或Genemapper软件判读基因型；

G、在没有荧光标定和检测条件下，对上述步骤A至B，采用各微卫星引物对按照上述PCR扩增条件直接扩增基因组DNA，通过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，依据电泳胶上不同等位基因片段大小的不同，判别出不同基因型；

H、数据分析：使用POPgene 1.32或POPGENE软件计算树鼩微卫星等位基因频率，种群杂合度；用PowerStats V1.2软件计算多态信息含量，个体识别率，非父排除率，亲权指数；用Cervus 3.0软件计算无效等位基因频率，相似率，同胞相似率、及亲权鉴定有关的指标。