[发明专利]基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，属生物高技术领域。

背景技术：

中国树鼩(Tupaia belangeri chinensis)，隶属于树鼩目(Scandentia)，树鼩科(Tupaiidae)，树鼩属(Tupaia)动物。形似松鼠，同时具有食虫目(Insectivora)和灵长类(Primates)动物的一些特征。树鼩吻部较长，指(趾)端具爪，齿式和食性等特征与食虫目动物相似，而其发达的大脑、头骨结构、中耳部结构、肌群组成和肠胃道结构等与灵长类动物相似，因此其系统分类地位一直是分类学上争论的话题。上世纪80年代，根据树鼩众多形态系统发生和分子系统发生的研究，一些学者提出建立树鼩目，将其置于食虫目与灵长目之间。现有遗传学证据表明树鼩和灵长类动物关系密切，是其近亲。

由于树鼩个体小，饲养繁殖周期短，成本低，且具有多种自发性疾病，在疾病和正常情况下都表现出诸多与灵长类动物相似的特征，已被大量运用于生物医学研究，并有望在某些方面替代数量日趋减少的濒危的非人灵长类实验动物。目前，树鼩被广泛运用于近视、肝炎、肝癌、抑郁症、糖尿病和微生物感染等疾病的研究，实验用树鼩呈现了供不应求的状态。虽然树鼩的人工饲养繁殖工作早在19世纪80年初就已开展，但到目前为止，依然没有建立一个纯的实验品系，且缺少一种能用于个体识别和纯系评估的分子遗传标识系统。现有文献报道中所用的树鼩大多是野外捕获的，或者是捕获后只经过短期的室内驯养。然而，野外生存的树鼩种群存在丰富的遗传多样性，这导致不同实验所采用的树鼩的遗传背景存在较大差异，往往研究结果出现巨大差异。为了更好地推进新型实验动物树鼩的模式化和遗传背景清晰的品系的创制，合理开发利用树鼩资源，建立一套树鼩个体识别和纯系评定的遗传标识系统尤为迫切。

用于遗传分析的分子标记有多种，如限制性长度片段多态(Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP)，随机扩增多态性DNA(RandomAmplified PolymorphicDNA，RAPD)，数目可变串联重复多态(Variable Number Tandem Repeat，VNTR)和微卫星(microsatellite)。微卫星又称为简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)或短片段重复序列(Short Tandem Repeat，STR)，是由1-6bp的碱基作为核心重复单元，串联重复形成的一类DNA序列。由于微卫星广泛且较均匀地分布在基因组中(约30-50kb就存在一个微卫星DNA)，具有丰富的多态性、信息含量大、呈共显性、符合孟德尔遗传规律等特点，被广泛运用于连锁图谱构建、种群遗传多样性分析、品种品系的选择和建立、以及不同品系间亲缘关系界定、个体识别和亲权鉴定等。要评估建立的树鼩品种或品系是否遗传背景清晰，首先需要检测一套分子遗传标记。因此，本发明针对现有技术的不足，提出一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法。

经文献检索，未见与本发明树鼩微卫星遗传标记相同的公开文献报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，用于检测树鼩种群杂合度、群体结构、个体识别和亲权鉴定。

本发明以Ensembl数据库下载的树鼩基因组序列为模板，搜寻微卫星序列，用Primerpremier 5软件设计用于扩增微卫星序列的引物对。经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，不断优化扩增条件，最后得到12对具有等位基因多态性和特异性扩增的树鼩微卫星序列的引物。这12个树鼩微卫星座位的扩增引物信息、微卫星序列的重复元件、扩增片段长度范围以及扩增条件列于表1中。基于全自动测序仪的DNA片段分析(GENESCAN)原理，将每对引物的正向引物用5′-FAM标记后，利用优化好的扩增条件，再次进行PCR扩增，并将PCR产物与一定量的分子内标混合，分别在ABI PRISM3730型或其他型号全自动测序仪(Applied Biosystems)上扫描检测。具有多态性的微卫星位点扩增出的PCR产物依据长度的不同，在电泳中显示出不同的迁移率，其带有的FAM标记荧光信号在电泳过程中被测序仪检测。依据分子内标的条带数与片段大小，我们利用相关软件即能判读出目的片段的大小。

表1.中国树鼩12个多态性微卫星座位的引物序列、产物长度、扩增条件及重复元件