[发明专利]一种防治番茄灰霉病的生防酵母菌的构建方法

摘要

一种防治番茄灰霉病的生防酵母菌的构建方法，它涉及一种生防酵母菌的构建方法。方法：一、提取淡色生赤壳菌WY-1的总RNA，然后逆转录，合成cDNA第一链，再PCR扩增，得目的基因；二、目的基因连接YEp73-T载体，然后转化大肠杆菌，再提取质粒载体YEp73，目的基因与质粒载体YEp73双酶切，回收目的片段，连接并构建重组质粒YEp73-Crchi1；三、浅白隐球酵母菌WY-1复苏后诱发突变，经筛选后得Leu-营养缺陷型突变株；四、将重组质粒YEp73-Crchi1转化到Leu-营养缺陷型突变株中即完成。本发明构建的防治番茄灰霉病的生防酵母菌可有效的防治灰霉病的发生，抑菌效果指数达76.7％。

主权项

一种防治番茄灰霉病的生防酵母菌的构建方法，其特征在于防治番茄灰霉病的生防酵母菌的构建方法按以下步骤进行：一、采用TRIzol试剂法提取淡色生赤壳菌WY‑1的总RNA，根据几丁质酶Crchi1基因，利用Primer Premier5.0软件设计特异上游引物CrchilF和下游引物CrchilR，然后以淡色生赤壳菌WY‑1的总RNA为模板进行逆转录，合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得目的基因；二、目的基因经1％琼脂糖凝胶电泳分离后连接到YEp73‑T载体上，所得连接产物转化大肠杆菌JM109及阳性克隆子的筛选与鉴定，然后采用小量法提取质粒载体YEp73，再将目的基因与质粒载体YEp73分别经Sal I和BamH I进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒YEp73‑Crchi1；三、将浅白隐球酵母菌WY‑1划线接种到YPD固体培养基上，在30℃下复苏培养48h，然后采用诱变剂甲基磺酸乙酯进行诱发突变，经筛选后获得浅白隐球酵母菌WY‑1的Leu‑营养缺陷型突变株；四、将重组质粒YEp73‑Crchi1转化到浅白隐球酵母菌WY‑1的Leu‑营养缺陷型突变株中，即完成防治番茄灰霉病的生防酵母菌的构建；其中步骤一中上游引物Crchi1F为GCGTCGACCCCACTTGCGGGAATGTCGT，下游引物Crchi1R为CGGGATCCGAAGTATGCCAAGCGAGGG。