[发明专利]胶体金标记Iap基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒

摘要

一种胶体金标记Iap基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒，属于卫生学检验及医学检验技术领域，其特征是：a.引物设计；b.PCR扩增的反应条件；c.琼脂糖凝胶电泳的反应条件；e.应用热休克转化法；f.SDS裂解法纯化试剂盒制备质粒；g.蛋白的诱导表达；h.SDS-PAGE电泳；j.从SDS-PAGE电泳凝胶中切下所需条带；k.采用柠檬酸三钠还原法并稍作改进制备胶体金；有益效果是：改进了过去针对单一菌属单一抗原测定的局限性。抗体纯、效价高，提高了敏感度和准确度。对单增李斯特菌进行检测，同ELISA法和PCR法比较，免疫胶体金层析对李斯特菌的检测具有快速、便捷的优点。

主权项

1、一种胶体金标记Iap基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒，其特征是：a、引物设计L.monocytogenes Iap蛋白基因序列ORIGIN1 atgaatatga aaaaagcaac tatcgcggct acagctggga ttgcggtaacagcatttgct61 gctccaacaa tcgcatccgc aagcactgta gtagttgaag ctggtgatactctttggggt121 atcgcacaaa gtaaagggac tactgttgac gcaattaaaa aagcaaacaatttaacaaca181 gataaaatcg taccaggtca aaaattacaa gtaaatgagg ttgctgctgctgaaaaaaca241 gagaaatctg ttagcgcaac ttggttaaac gttcgtagtg gcgctggtgttgataacagt301 attattacgt caatcaaagg cggaacaaaa gtaactgttg aatcaaccgaatctaatggc361 tggaacaaaa ttacttacaa cgacggggaa actggtttcg ttaacggtaaatacttaact421 gacaaagtag caagcactcc tgttgcacca acacaagaag tgaaaaaagaaactactatt481 caacaagctg cacctgctgc agaaacaaaa actgaagtaa aacaaactacacaagcaact541 acacctgcac ctaaagtagc agaaacgaaa gaaactccag tggtagatcaaaatgctact601 acacacgctg ttaaaagcgg tgacactatt tgggctttat ccgtaaaatacggtgtttcc661 gttcaagaca ttatgtcatg gaataattta tcttcttctt ctatttatgtaggtcaaaaa721 cttgctatta aacaaacagc caacacagtt actccaaaag cagaagtgaaaaaagaagct781 ccagcagctg aaaaacaagc tgcaccagta gttaaagaaa atactaacactaacacaaat841 actactacag agaaaaaaga aacaacacaa caacaaacag cacctaaagcaccaacagaa901 gctgcaaaac cagctcccgc accatctaca aacacaaatg ctaataaaacgaatacgaat961 acaaacaata ctaatacaag tacaccatct aaaaatacca atactaatacaaactccaat1021 acgaatacaa actcaaatac gaatgctaat caaggttctt ctaacaataacagcaattca1081 agtgcaagtg ctattattgc tgaagctcaa aaacaccttg gaaaagcttattcatggggt1141 ggtaacggac caactacatt tgattgctct ggttacacta aatatgtatttgctaaagcg1201 ggaatctccc ttccacgtac ttctggcgca caatacgcta gcactacaagaatctctgaa1261 tctcaagcaa aacctggtga tttagtattc tttgactatg gtagcggaatttctcacgtt1321 ggtatctacg ttggtaatgg tcaaatgatt aacgcgcaag acaatggcgttaaatacgat1381 aacatccacg gctctggctg gggtaaatat ctagttggct tcggtcgcgt ataa//GenBank中的L.monocytogenes Iap蛋白基因序列，应用Primer Premier5.0，DNA Club和Oligo 6.0设计特异性引物P1和P2，预期扩增长度为1434bp，在NCBIGENEBANK中找到基因序列后，看选择的酶切位点，在所要进行PCR的基因序列中是否存在；用Primer primer5把序列反向互补；在应用Oligo 6.0引物设计时，上下游引物全长输入；上游引物位点的确定为5’端模板第一个碱基前面的所有碱基的负数值+1下游引物位点的确定为下游引物-酶切位点-保护性碱基＝A，序列全长-A+1＝下游引物位点；上游引物P15′-GCGGATCCATGAATATGAAAAAAGCAACTATCGCGGC-3′；下游引物P25′-CTCGAGTACGCGACCGAAGCCAACTAGATATT-3′为下一步克隆需要，分别在上、下游引物中引入BamH I和Xho I酶切位点b、PCR扩增的反应条件PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性1min，55-65℃退火1min，72℃延伸2min，扩增30个循环，72℃延伸10min；c、琼脂糖凝胶电泳的反应条件用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，电压100V，电泳30min；d、切下目的DNA片段，用凝胶快速纯化回收试剂盒回收；将回收纯化的PCR产物与pMD18-T进行连接，并pMD18-T载体16℃12小时以上连接；制备感受态细胞：应用CaCl2致敏法制备大肠杆菌感受态，接种JM109菌种，37℃，225rpm12小时振摇培养后，菌液在LB固体培养基上划线，37℃孵箱过夜培养，筛选单克隆；选一单菌落接种于5mL LB培养基中，12小时以上培养，培养物按1/100接种于LB培养基中，培养至A600达0.45-0.55，用CaCl2致敏大肠杆菌；e、应用热休克转化法，将连接反应液加入100μL感受状态的细胞中，再加3μlDMSO以增加转化效率，冰浴30min后，42℃休克45s，然后迅速冰浴5min，再将转化产物加入LB液体培养基中复苏30min后，离心收集菌体，将其铺于含筛选抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温孵箱放置16h后观察转化效果；f、SDS裂解法纯化试剂盒制备质粒；用BamH I和Xho I进行酶切鉴定及PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒，命名为pMD18-T-Iap；用BamH I和Xho I进行亚克隆，表达载体pET28a和重组克隆载体pMD18T-Iap用BamH I和Xho I切处理，琼脂糖凝胶电泳，线性表达载体用DNA快速纯化回收试剂盒回收，亚克隆片段用挤胶法回收，亚克隆载体与片段用T4DNA连接酶连接，连接产物转化JM109感受态，提取质粒，鉴定阳性克隆；g、蛋白的诱导表达用pET28a-Iap重组质粒转化BL21受体菌，选择单克隆接种到5mL LB培养液里，按传统方式诱导表达，即37℃，225rpm振荡培养至A600达0.6-0.8，加IPTG至1mmol/L，对照组不加IPTG，3h后收集细菌；同时接种诱导菌种，提取质粒，BamH I和Xho I酶切验证确含目的片段后，进行测序，测序正确后进行重组蛋白的后续实验；h、SDS-PAGE电泳将诱导后菌液30mL 11000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，向菌体沉淀中加入2×SDS凝胶加样缓冲液1000μl，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳，操作过程如下12％的分离胶15mL，水4.9mL、30％丙烯酰胺6.0mL、1.5mol/L Tris-HCl其pH 8.8的3.8mL、10％SDS 150mL、10％过硫酸铵150mL、TEMED 6mL，迅速灌注于两层玻璃板的间隙，在胶上小心覆盖一层蒸馏水，凝胶垂直置于室温，聚合完全后，倒出覆盖的水，用滤纸将水吸净；制备8mL积层胶，水5.5mL、30％丙烯酰胺1.3mL、1.0mol/L Tris-HCl其pH 6.8的1.0mL、10％SDS 80mL、10％过硫酸铵80mL、TEMED 8mL，直接注于分离胶上层，立即在积层胶中插入干净的Teflon梳子，小心避免形成气泡；积层胶聚合完全后，小心移出Teflon梳子，将凝胶固定于电泳装置上，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0.1％SDS，上电泳样品及蛋白质Marker，电压200v电泳45min，电泳结束后凝胶加入考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后，将凝胶浸泡于水中，拍照记录；j、从SDS-PAGE电泳凝胶中切下所需条带，大约用两天时间将其冻干，并碾成粉末。用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定，制作蛋白标准曲线；595nm处比色，得吸光度，查标准曲线，得到蛋白浓度；将抗原溶于生理盐水中，配制浓度为1μg/μl。免疫BALB/c小鼠，4-6周，加强免疫；小鼠腹水的诱导取BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，每只0.5ml.7-10天后，收集杂交瘤细胞，离心，去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度为3×107个/ml，每只小鼠注射1ml；设阴性对照、盐水对照。约10天后，小鼠腹部增大，开始收集腹水；用12号针头扎入腹部，挤压，使腹水流出，收集至离心管，并使劲晃动离心管防止腹水凝结；1000转离心5分钟，吸取上清，注意去掉上面一层脂肪；分装，-20℃冻存；k、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法并稍作改进制备胶体金；胶体金制备，取1％氯金酸溶液2.5ml加入到250ml容量瓶中，加双蒸水至标定刻度线，使氯金酸溶液的浓度为1‰，沸水浴10min，加入1％柠檬酸三钠溶液6.65ml；快速搅拌直至颜色彻底变为紫红色，继续沸水10min，取出。凉至室温后，用双蒸水恢复至原体积；置4℃冰箱保存备用；测定胶体金在515nm波长具有最大吸收峰，确定胶体金直径大小为10nm；胶体金探针制备：取新鲜制备的胶体金溶液50ml，加入0.2mol/L K2CO3，调pH至8.2，置磁力搅拌器上调适量转速，然后加入适量的已纯化好的抗体；使抗体浓度恰好在稳定蛋白质的最小量上；缓慢搅拌10min，加入牛血清白蛋白BSA，使BSA的终浓度为I％，继续搅拌10min。将上述胶体金一抗体一BsA液进行4000r/min离心20min，收集上清。将收集的上清进行4℃、10000r/min离心60min。弃上清，沉淀用含1％BSA的0.01mol/L；pH7.4PBS悬浮；同上4℃，10000r/min离心60min两次，最后将沉淀用5ml PBS-T溶解；并加入少量的Na3N，4℃冰箱保存备用；层析试纸条组装试纸条由吸水纤维、硝酸纤维膜、玻璃纤维和PVC板组成。硝酸纤维膜处理，中段相隔5mm分别用羊抗鼠IgG对照线和单核李斯特菌抗体检测线划线，形成两条宽约1mm的线段，干燥后用含1％BSA的PBS封闭12小时以上，37℃干燥；试纸条组装，取洁净PVC板，将处理好的硝酸纤维膜粘在PVC板中部合适位置；将2cm吸水纤维粘在PVC板上端并部分压在硝酸纤维膜上，0.8cm玻璃纤维粘在PVC板下端并部分压在硝酸纤维膜上，切成宽5mm的条带，即为层析试纸条；干燥剂密封冷冻保存。