[发明专利]一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法

摘要

本发明涉及一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，包括：(1)活化的尼龙膜经羟乙基纤维素键合改性；(2)改性后的尼龙膜与环氧氯丙烷、氢氧化钠和硼氢化钠的混合溶液反应，再将膜分别浸入碳酸钠、硼氢化钠和偶联剂的混合溶液和硫酸锌溶液，得到螯合锌离子的金属亲和膜；(3)将上述金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入Tris－HCl缓冲液和洗脱液，接着送入菠萝蛋白酶溶液，然后以洗脱剂进行洗脱，得到菠萝蛋白酶；(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。本发明方法快速、高效、简便、分离量大，提取的酶活性好，适用于工业规模化。

主权项

1.一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，包括：(1)尼龙膜的改性：活化后的尼龙膜浸入100ml 1wt％～3wt％的羟乙基纤维素溶液中，室温反应1～3h，然后转入烘箱，60-90℃烘干1～3h，用1wt％～3wt％曲通拉X-100聚乙二醇辛基苯基醚的氢氧化钠NaOH溶液洗去未反应的羟乙基纤维素，再在去离子水中清洗1～3天；(2)尼龙膜螯合金属锌离子：将上述尼龙膜浸入4～5ml环氧氯丙烷、40～55ml氢氧化钠和3～6mmol硼氢化钠的混合溶液中，室温反应1～3h后，加入20～30ml环氧氯丙烷溶液和40～50ml氢氧化钠溶液，继续恒温振荡反应8～18h，洗涤后再将膜浸入110～120ml碳酸钠、6～9mmol硼氢化钠和80～90mmol偶联剂亚氨基二乙酸IDA的混合溶液，50～70℃反应10～15h，最后浸入500ml 50～150ppm的硫酸锌溶液，反应1～3h，得到螯合锌离子的金属亲和膜；(3)蛋白酶的吸附洗脱：将金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，以0.05mol/L pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液平衡15min，流速2.0ml/min；接着送入100ml 0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～9.0的菠萝蛋白酶溶液，其中氯化钠浓度为0～2.0mol/L，反应10～100min进行吸附，然后以Tris-HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质，最后以洗脱剂进行洗脱，得到菠萝蛋白酶；(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。