[发明专利]一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白酶的提纯领域，特别是涉及一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法。

背景技术

菠萝蛋白酶(Bromelain)简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素，酶学编号EC3.4.22.32，是从菠萝果茎、柄、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。它是一类巯基蛋白酶，其活性中心为疏基(--SH)，能进行蛋白质水解等各种生化反应，它可广泛应用于食品、医药及生物等行业，作为食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白等的生产。

菠萝蛋白酶的传统提取工艺为吸附法和沉淀法，但是这两种方法工艺繁琐，纯度不能达到制药工业的需求。《高活性菠萝蛋白酶提取的研究》一文是采用纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥技术工艺，从菠萝茎、皮中提取菠萝蛋白酶，可以有效保持蛋白酶的活性，还有报道是利用酒精作为沉淀剂来提纯菠萝蛋白酶，这些方法都存在产物纯度低，酶活低等缺陷。专利CN1980165公开了一种菠萝蛋白酶的物理提取方法，包括将原料进行清洗、粉碎预处理，再榨汁、离心、冷冻，然后经过滤、超滤、反渗透和真空干燥处理；专利CN1186118提供了一种菠萝蛋白酶的提取方法，是将菠萝植株进行冷冻预处理，然后破碎榨汁、超滤、反渗透、再冷冻干燥，物理提取方法所得菠萝蛋白酶的纯度和酶活性高，然而成本较高，工艺耗能大。

膜是具有选择性分离功能的材料，利用它能够实现料液不同组分的分离、纯化和浓缩，其特点是表面积大、扩散路径短、操作压低、处理量大，膜可以在分子范围内进行分离，但传统膜分离技术只有分离相对分子质量相差10倍以上的物系，不能满足生化分离的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，该方法快速、高效、简便、分离量大，适于工业规模化。

本发明的一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，包括：

(1)尼龙膜的改性：活化后的尼龙膜浸入100ml 1wt％～3wt％的羟乙基纤维素溶液中，室温反应1～3h，然后转入烘箱，60-90℃烘干1～3h，用1wt％～3wt％曲通拉(X-100)(聚乙二醇辛基苯基醚)的氢氧化钠NaOH溶液洗去未反应的羟乙基纤维素，再在去离子水中清洗1～3天；

(2)尼龙膜螯合金属锌离子：将上述尼龙膜浸入4～5ml环氧氯丙烷、40～55ml氢氧化钠和3～6mmol硼氢化钠的混合溶液中，室温反应1～3h后，加入20～30ml环氧氯丙烷溶液和40～50ml氢氧化钠溶液，继续恒温振荡反应8～18h，洗涤后再将膜浸入110～120ml碳酸钠、6～9mmol硼氢化钠和80～90mmol偶联剂亚氨基二乙酸(IDA)的混合溶液，50～70℃反应10～15h，最后浸入500ml 50～150ppm的硫酸锌溶液，反应1～3h，得到螯合锌离子的金属亲和膜；

(3)蛋白酶的吸附洗脱：将金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，以0.05mol/L pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液平衡15min，流速2.0ml/min；接着送入100ml 0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～9.0的菠萝蛋白酶溶液，其中氯化钠浓度为0～2.0mol/L，反应10～100min进行吸附，然后以Tris-HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质，最后以洗脱剂进行洗脱，得到菠萝蛋白酶；

(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。

所述的步骤(1)中尼龙膜活化是指尼龙膜先在25℃1 mol/L HCl中水解24h，然后浸入20ml甲醛溶液，加入0.2ml 85wt.％的磷酸，于60℃反应7h，40～50℃热水洗涤。

所述的步骤(1)中NaOH溶液的浓度为0.1～0.3mol/L。

所述的步骤(2)中环氧氯丙烷浓度为95wt％～100wt％，氢氧化钠和碳酸钠溶液的浓度为1～3mol/L；环氧氯丙烷、氢氧化钠与硼氢化钠的混合溶液中，三者的体积比为0.9～1.1∶8～11∶0.003～0.005。

所述的步骤(2)中洗涤分别用去离子水和4.0vol％～8.0vol％的醋酸洗涤。

所述的步骤(3)中最佳提纯条件为：反应时间为60min，pH＝7.0，菠萝蛋白酶的吸附浓度为2.0mg/ml，离子强度为0mol/L的氯化钠溶液，即菠萝蛋白酶溶液中不含氯化钠溶液。

所述的步骤(3)中洗脱剂为0.5～1.5mol/L的硫氰酸钠。

有益效果