[发明专利]一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，包括：

(1)尼龙膜的改性：活化后的尼龙膜浸入100ml 1wt％～3wt％的羟乙基纤维素溶液中，室温反应1～3h，然后转入烘箱，60-90℃烘干1～3h，用1wt％～3wt％曲通拉X-100聚乙二醇辛基苯基醚的氢氧化钠NaOH溶液洗去未反应的羟乙基纤维素，再在去离子水中清洗1～3天；所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.3mol/L；

(2)尼龙膜螯合金属锌离子：将上述改性后的尼龙膜浸入4～5ml环氧氯丙烷、40～55ml氢氧化钠和3～6mmol硼氢化钠的混合溶液中，室温反应1～3h后，加入20～30ml环氧氯丙烷溶液和40～50ml氢氧化钠溶液，继续恒温振荡反应8～18h，洗涤后再将膜浸入110～120ml碳酸钠、6～9mmol硼氢化钠和80～90mmol偶联剂亚氨基二乙酸IDA的混合溶液，50～70℃反应10～15h，最后浸入500ml 50～150ppm的硫酸锌溶液，反应1～3h，得到螯合锌离子的金属亲和膜；所述环氧氯丙烷浓度为95wt％～100wt％，氢氧化钠和碳酸钠溶液的浓度为1～3mol/L；环氧氯丙烷、氢氧化钠与硼氢化钠的混合溶液中，三者的体积比为0.9～1.1∶8～11∶0.003～0.005；洗涤分别用去离子水和4.0vol％～8.0vol％的醋酸洗涤；

(3)蛋白酶的吸附洗脱：将金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，以0.05mol/L pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液平衡15min，流速2.0ml/min；接着送入100ml 0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～9.0的菠萝蛋白酶溶液，其中氯化钠浓度为0～2.0mol/L，反应10～100min进行吸附，然后以Tris-HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质，最后以洗脱剂进行洗脱，得到菠萝蛋白酶；所述洗脱剂为0.5～1.5mol/L的硫氰酸钠；

(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。

2.根据权利要求1所述的利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中尼龙膜活化是指尼龙膜先在25℃ 1mol/L HCl中水解24h，然后浸入20ml甲醛溶液，加入0.2ml 85wt.％的磷酸，于60℃反应7h，40～50℃热水洗涤。