[发明专利]一种乙型肝炎病毒基因分型的方法

摘要

本发明公开了一种乙型肝炎病毒基因分型的方法，涉及病毒分类。该方法基于MASA液相芯片技术对乙肝病毒基因进行分型，主要根据乙肝病毒八种基因型的特点设计基因型特异的引物及探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex仪器进行检测，根据检测值的大小来确定乙肝病毒属于八种基因型的哪一种。对病人体内的乙肝病毒进行基因分型，将有利于对疾病的进程进行预测，也可用于研究乙肝病毒的进化与发展。与现有技术相比，本发明具有：操作简单，特异性高，假阳性少，灵敏度高，结果明确，对目前已知的所有8种基因型乙肝病毒都可进行明确的区分，且费用较低，适合大范围的推广应用。

主权项

1、一种乙型肝炎病毒基因分型的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：a、提取样品中的DNA；b、以步骤a中提取的DNA为模板进行第一轮PCR，在PCR管中加入25uL下列物质：10×PCR缓冲液：2.5uL四种脱氧核糖核苷酸：0.5uL浓度为20umol/L所有型引物F：0.25uL浓度为20umol/L所有型引物R：0.25uLTaqDNA聚合酶：0.5uLDNA模板：0.5～5uL余者为超纯水；其中：所有型引物F为：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCCTAGGACCCCTGCTCGT所有型引物R为：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGAGGCATAGCAGCAGGATGC、将PCR管放入PCR仪，条件如下：c1、94℃5分钟c2、94℃30秒c3、57℃30秒c4、72℃30秒c5、重复29次步骤c2～c4c6、72℃15分钟c7、降到4℃得到扩增的目标基因溶液；d、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中再加入50uL下列物质：10×PCR缓冲液：5uL四种脱氧核糖核苷酸：1uL浓度为20umol/L第二轮PCR引物F：0.5uL浓度为20umol/L第二轮PCR引物R：0.5uLTaq DNA聚合酶：1uL扩增的目标基因溶液：0.1～0.5uL余者为超纯水；其中：第二轮PCR引物F为：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二轮PCR引物R为：生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGe、将PCR管放入PCR仪，条件如下：e1、94℃5分钟e2、94℃30秒e3、60℃30秒e4、72℃30秒e5、重复29次步骤e2～e4e6、72℃15分钟e7、将温度降到4℃得到带有生物素标记的目标基因溶液；f、把所有型探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球，其中：所有型探针的序列为：NH2-TTTTTTTTTGAGAGAAGTCCACCACGAG；g、在棕色容器中加入：TE缓冲液：12uL带有生物素标记的目标基因溶液：5uL微球：33uL；h、将棕色容器置于94℃5分钟，再移至57℃温育15分钟，然后移到冰上，加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57℃温育5分钟，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；i、用Luminex仪器读取给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；j、当荧光检测值＜100时，说明样品中基本不含乙肝病毒DNA，停止检测；k、当100≤荧光检测值＜200时，样品中是否含乙肝病毒DNA不确定；当荧光检测值≥200时，确定样品中含有乙肝病毒DNA；对这两种情况都用下列步骤作进一步的检测；l、分别用八种基因型的第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R，以步骤a中的提取的DNA为模板分别进行第一轮PCR，八种基因型的引物序列如下：基因型A引物F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACTTCCGGARACTACTGTTG基因型A引物R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTTCTGCGACGCGGCGAT基因型D引物F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCACCATATTCTTGGGAACAA基因型D引物R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCCAACTGRTGATCGGGRAAG基因型G引物F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACTGTTCAAGCCTCCAAGCT基因型G引物R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGAGCAACTCCACAGTAGCT基因型B引物F、基因型C引物F、基因型E引物F、基因型F引物F、基因型H引物F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCT基因型B引物R、基因型C引物R、基因型E引物R、基因型F引物R、基因型H引物R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGACCAATTTATGCCTACAGCCm、在PCR管中加入25uL下列物质：10×PCR缓冲液：2.5uL四种脱氧核糖核苷酸：0.5uL浓度为20umol/L所有型引物F：0.25uL浓度为20umol/L所有型引物R：0.25uLTaq DNA聚合酶：0.5uLDNA模板：0.5～5uL余者为超纯水；n、将PCR管放入PCR仪，条件如下：c1、94℃5分钟c2、94℃30秒c3、57℃30秒c4、72℃30秒c5、重复29次步骤c2～c4c6、72℃15分钟c7、降到4℃得到扩增的目标基因溶液；o、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中再加入50uL下列物质：10×PCR缓冲液：5uL四种脱氧核糖核苷酸：1uL浓度为20umol/L第二轮PCR引物F：0.5uL浓度为20umol/L第二轮PCR引物R：0.5uLTaq DNA聚合酶：1uL扩增的目标基因溶液：0.1～0.5uL余者为超纯水；其中：第二轮PCR引物F为：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二轮PCR引物R为：生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGp、将PCR管放入PCR仪，条件如下：e1、94℃5分钟e2、94℃30秒e3、60℃30秒e4、72℃30秒e5、重复29次步骤e2～e4e6、72℃15分钟e7、将温度降到4℃；得到带有生物素标记的目标基因溶液；q、把与步骤n相同基因型的探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；八种基因型的探针序列如下：基因型A探针：NH2-TTTTTTTCTGCCTCGGTCYCGTCGTC基因型B探针：NH2-TTTTTTTTTTTTGGGCAGGTTCCIGTGGGC基因型C探针：NH2-TTTTTTTTTTTTRGGCAAGACCTGGYGGGC基因型D探针：NH2-TTTTTTTGGAAAGATTCTGCCCCATGC基因型E探针：NH2-TTTTTTTTTTCCTTGGGCAAGATTTGGTGGG基因型F探针：NH2-TTTTTTTTTTTGTTGGCAAACTCCAGGGGGC基因型G探针：NH2-TTTTTGGCCATATGGCAAAGTTGTTC基因型H探针：NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGGCAAGTTCCAAGGGGCr、在棕色容器中加入：TE缓冲液：12uL带有生物素标记的目标基因溶液：5uL微球：33uLs、将棕色容器置于94℃5分钟，再移至57℃温育15分钟，然后移到冰上，加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57℃温育5分钟，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；t、用Luminex仪器分别读取八种给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；u、当目标基因荧光标记是由步骤m所使用引物及步骤q所使用探针的基因型得到，则当该目标基因荧光标记的荧光检测值＜100时，说明样品中基本不含该基因型的乙肝病毒DNA；v、当100≤该目标基因荧光标记的荧光检测值＜200时，样品中是否含该基因型的乙肝病毒DNA不确定；当荧光检测值≥200时，确定样品中含有该基因型的乙肝病毒DNA。