[发明专利]一种乙型肝炎病毒基因分型的方法

权利要求书

1、一种乙型肝炎病毒基因分型的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：

a、提取样品中的DNA；

b、以步骤a中提取的DNA为模板进行第一轮PCR，在PCR管中加入25uL下列物质：

10×PCR缓冲液：2.5uL

四种脱氧核糖核苷酸：0.5uL

浓度为20umol/L所有型引物F：0.25uL

浓度为20umol/L所有型引物R：0.25uL

TaqDNA聚合酶：0.5uL

DNA模板：0.5～5uL

余者为超纯水；

其中：所有型引物F为：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCCTAGGACCCCTGCTCGT

      所有型引物R为：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGAGGCATAGCAGCAGGATG

C、将PCR管放入PCR仪，条件如下：

c1、94℃5分钟

c2、94℃30秒

c3、57℃30秒

c4、72℃30秒

c5、重复29次步骤c2～c4

c6、72℃15分钟

c7、降到4℃

得到扩增的目标基因溶液；

d、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中再加入50uL下列物质：

10×PCR缓冲液：5uL

四种脱氧核糖核苷酸：1uL

浓度为20umol/L第二轮PCR引物F：0.5uL

浓度为20umol/L第二轮PCR引物R：0.5uL

Taq DNA聚合酶：1uL

扩增的目标基因溶液：0.1～0.5uL

余者为超纯水；

其中：第二轮PCR引物F为：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC

      第二轮PCR引物R为：生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG

e、将PCR管放入PCR仪，条件如下：

e1、94℃5分钟

e2、94℃30秒

e3、60℃30秒

e4、72℃30秒

e5、重复29次步骤e2～e4

e6、72℃15分钟

e7、将温度降到4℃

得到带有生物素标记的目标基因溶液；

f、把所有型探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球，

其中：所有型探针的序列为：NH2-TTTTTTTTTGAGAGAAGTCCACCACGAG；

g、在棕色容器中加入：

TE缓冲液：12uL

带有生物素标记的目标基因溶液：5uL

微球：33uL；

h、将棕色容器置于94℃5分钟，再移至57℃温育15分钟，然后移到冰上，加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57℃温育5分钟，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；

i、用Luminex仪器读取给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；

j、当荧光检测值＜100时，说明样品中基本不含乙肝病毒DNA，停止检测；

k、当100≤荧光检测值＜200时，样品中是否含乙肝病毒DNA不确定；当荧光检测值≥200时，确定样品中含有乙肝病毒DNA；对这两种情况都用下列步骤作进一步的检测；

l、分别用八种基因型的第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R，以步骤a中的提取的DNA为模板分别进行第一轮PCR，八种基因型的引物序列如下：

基因型A引物F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACTTCCGGARACTACTGTTG

基因型A引物R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTTCTGCGACGCGGCGAT

基因型D引物F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCACCATATTCTTGGGAACAA

基因型D引物R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCCAACTGRTGATCGGGRAAG

基因型G引物F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACTGTTCAAGCCTCCAAGCT

基因型G引物R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGAGCAACTCCACAGTAGCT

基因型B引物F、基因型C引物F、基因型E引物F、基因型F引物F、基因型H引物F：

CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCT

基因型B引物R、基因型C引物R、基因型E引物R、基因型F引物R、基因型H引物R：

TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGACCAATTTATGCCTACAGCC

m、在PCR管中加入25uL下列物质：

10×PCR缓冲液：2.5uL

四种脱氧核糖核苷酸：0.5uL

浓度为20umol/L所有型引物F：0.25uL

浓度为20umol/L所有型引物R：0.25uL

Taq DNA聚合酶：0.5uL

DNA模板：0.5～5uL

余者为超纯水；

n、将PCR管放入PCR仪，条件如下：

c1、94℃5分钟

c2、94℃30秒

c3、57℃30秒

c4、72℃30秒

c5、重复29次步骤c2～c4

c6、72℃15分钟

c7、降到4℃

得到扩增的目标基因溶液；

o、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中再加入50uL下列物质：

10×PCR缓冲液：5uL

四种脱氧核糖核苷酸：1uL

浓度为20umol/L第二轮PCR引物F：0.5uL

浓度为20umol/L第二轮PCR引物R：0.5uL

Taq DNA聚合酶：1uL

扩增的目标基因溶液：0.1～0.5uL

余者为超纯水；

其中：第二轮PCR引物F为：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC

      第二轮PCR引物R为：生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG

p、将PCR管放入PCR仪，条件如下：

e1、94℃5分钟

e2、94℃30秒

e3、60℃30秒

e4、72℃30秒

e5、重复29次步骤e2～e4

e6、72℃15分钟

e7、将温度降到4℃；

得到带有生物素标记的目标基因溶液；

q、把与步骤n相同基因型的探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；八种基因型的探针序列如下：

基因型A探针：NH2-TTTTTTTCTGCCTCGGTCYCGTCGTC

基因型B探针：NH2-TTTTTTTTTTTTGGGCAGGTTCCIGTGGGC

基因型C探针：NH2-TTTTTTTTTTTTRGGCAAGACCTGGYGGGC

基因型D探针：NH2-TTTTTTTGGAAAGATTCTGCCCCATGC

基因型E探针：NH2-TTTTTTTTTTCCTTGGGCAAGATTTGGTGGG

基因型F探针：NH2-TTTTTTTTTTTGTTGGCAAACTCCAGGGGGC

基因型G探针：NH2-TTTTTGGCCATATGGCAAAGTTGTTC

基因型H探针：NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGGCAAGTTCCAAGGGGC

r、在棕色容器中加入：

TE缓冲液：12uL

带有生物素标记的目标基因溶液：5uL

微球：33uL

s、将棕色容器置于94℃5分钟，再移至57℃温育15分钟，然后移到冰上，加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57℃温育5分钟，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；

t、用Luminex仪器分别读取八种给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；

u、当目标基因荧光标记是由步骤m所使用引物及步骤q所使用探针的基因型得到，则当该目标基因荧光标记的荧光检测值＜100时，说明样品中基本不含该基因型的乙肝病毒DNA；

v、当100≤该目标基因荧光标记的荧光检测值＜200时，样品中是否含该基因型的乙肝病毒DNA不确定；当荧光检测值≥200时，确定样品中含有该基因型的乙肝病毒DNA。