[发明专利]一种乙型肝炎病毒基因分型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒鉴定，更具体涉及乙型肝炎病毒的基因分型。

背景技术

一、乙型肝炎病毒(HBV)及MASA液相芯片技术

乙型肝炎病毒(HBV)简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科。根据目前所知，乙肝病毒只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗粒状，直径为42纳米，是英国科学家Dane于1970年首先发现，故又称Dane颗粒(丹氏颗粒)。Dane颗粒由外膜和内核两部分组成，外膜厚7纳米，由蛋白质和膜脂质组成，称作乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。中心部分的直径约28纳米，为病毒的核心，其中包括核心抗原(HBcAg)，病毒基因组DNA和合成病毒基因组的DNA多聚酶。乙肝病毒基因组编码四个基因，表面抗原基因(S、PreS1及PreS2基因)，DNA多聚酶基因(P基因)，X蛋白基因，核心抗原基因(C及PreC基因)。根据乙肝病毒基因组变异性大于8％，乙肝病毒分为A～H八个基因型。这些基因型在全球有显著的地域分布。A型和D型主要分布在欧洲和地中海地区，B型和C型主要分布在亚洲，E型主要分布在西非，F型和H型主要分布在中美洲及南美洲，G型主要分布在美国。

乙肝病毒感染是一个严重的公共卫生问题。全球60亿人口中，约20亿人曾感染过乙肝病毒，其中3.5～4亿人为慢性乙肝病毒感染，约占全球人口6％。在这3.5～4亿慢性乙肝病毒感染者中，约15％～25％最终将死于与乙肝病毒感染相关的肝病。而我国属于高流行区，根据2002年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明，我国一般人群中HBsAg流行率为9.09％，估计约1.2～1.3亿人为慢性乙肝病毒感染，占全世界慢性乙肝病毒感染者的1/3，全国每年死于与乙肝相关肝病约30万例。

根据研究，不同的基因型将导致不同的临床结果。例如在亚洲，乙肝病毒基因型以B和C为主，大量的研究发现，严重肝病的发生与基因型C的关系比基因型B的关系更密切。因此，对病人体内的乙肝病毒进行基因分型，将有利于对疾病的进程进行预测。此外，大范围的对乙肝病毒进行基因分型，可以用于研究乙肝病毒的进化与发展。

MASA液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能悬浮点阵仪)技术是美国纳斯达克市公司上研制出的新一代生物芯片技术平台。它是一个非常灵活的多功能技术平台。其关键是把微小的乳胶颗粒(Beads，微球)分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的核酸或蛋白以共价方式结合到给定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物(被检测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等，也可以时PCR产物)。在悬液中的微球与被检测物特异性地结合，并加上荧光标记。然后，微球成单列通过两束激光，一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)。所得的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。

美国纳斯达克市公司生产的Luminex仪器可以读取由藻红蛋白标记的基因产物的荧光强度。

二、现有乙肝病毒基因分型方法及其不足之处

1.基因序列测定法

1.1全基因序列测定法：是根据乙肝病毒基因组变异性大于8％进行分型，Okamoto这种方法区分出A～D型，E、G、F、H也通过序列分析得以证实，初步建立了基因分型体系，该方法直接可靠，但繁琐费时，不适宜广泛开展。

1.2表面抗原基因(S基因)序列测定法：Norder通过对乙肝病毒携带者S基因序列测序结果分析，证实了Okamoto的结果，还发现了两个新的基因型E、F，经证实，S基因序列分型最接近全基因组序列分型，初步简化了HBV基因分型方法。但相对而言，该方法仍然比较繁琐费时。

2.聚合酶链反应-限制性酶长度多态性分析(PCR-RFLP)：Lindh通过PCR扩增出目标基因片段(通常为S基因或PreS/S基因)，然后用给定的限制性内切酶进行酶切，根据酶切图谱进行基因分型。这种方法简明，但有时结果比较模糊，甚至完全不能判断。

3.基因型特异性引物PCR法：Naito等设计了A～F六种基因型的型特异性引物，并进行套式PCR，保证了同一基因型内核苷酸序列差异≤2，不同基因型间核苷酸序列差异≥3，并使不同基因型扩增产物的相对分子质量不同，在电泳后得出结果，可用于乙肝病毒感染的分子诊断和大范围调查。但是这种方法可能会出现假阳性，而且无法区分基因型F和基因型H。