本发明公开了一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用,所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变:P127、T128、L203、A46、S60、L207、D216、A254、D339、Q345、T420、A439、L452、A481、A500、G504、P515、A589、T590、A591、G602、L604、T605、S606或G608中任意一种或至少两种的组合。本发明通过设计氨基酸的一个或多个不同位点的突变,能够显著提高鼠白血病病毒逆转录酶突变体的酶活力,在相同的酶量投入下能够实现更佳的扩增效率,能够生成更多的逆转录产物。