本发明提供了一种Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法及其应用,属于生物技术领域。本发明还提供了一种靶向小鼠Mybpc3基因的gRNA,所述gRNA的核苷酸序列包括:gRNA‑A1,SEQ ID NO.1;gRNA‑B1,SEQ ID NO.2。本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对小鼠Mybpc3基因的蛋白质编码区c.3636T进行定点删除,首次构建了Mybpc3基因移码突变c.3636delT的小鼠模型,所述小鼠模型可以稳定传代。本发明中所得Mybpc3基因移码突变小鼠模型在肥厚型心肌病疾病机制的研究及靶向药物筛选中具有重要的应用价值。