[发明专利]以树眼镜蛇毒素的支架为基础的双功能或多功能分子

权利要求书

1、一种杂合多肽，它包括：第一个氨基酸序列和一段另外的氨基酸序列，所述的第一个氨基酸序列包含RGD基序并能赋予树眼镜蛇毒素活性，所述的另外的氨基酸序列能赋予除树眼镜蛇毒素活性以外的其他活性。

2、一种具有整联蛋白结合活性的杂合多肽，它包括一个树眼镜蛇毒素的支架和一个非树眼镜蛇毒素的另外的氨基酸序列。

3、如权利要求1或2所述的多肽，包括至少两个所述的另外的氨基酸序列，任选地所述的另外的氨基酸序列是相同的。

4、如权利要求1-3任一项所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列包括两个或多个被至少一个树眼镜蛇毒素的氨基酸残基隔开的氨基酸序列部分。

5、如权利要求1-4任一项所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列选自血小板衍生生长因子(PGDF)、糖蛋白IBα、水蛭素、凝血调节蛋白、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子-β1、碱性成纤维细胞生长因子、血管紧张肽II、因子VIII以及von Willebrand因子。

6、如前述任一个权利要求所述的多肽，包括如图3A、3B或3C所示的氨基酸序列。

7、如前述任一个权利要求所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被掺入树眼镜蛇毒素的支架的(a)环I和/或环II；(b)环I和/或环III；(c)环II和/或环III；或者(d)环I、环II和环III。

8、如权利要求7所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被掺入环I或者环II中。

9、如前述任一个权利要求所述的多肽，其中含RGD的环通过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基而被修饰，优选地树眼镜蛇毒素的环III中能被修饰的氨基酸的数目最多8个，最少1个。

10、如权利要求9所述的多肽，其中所述的RGD环具有如表1所示的氨基酸序列。

11、如前述任一个权利要求所述的多肽，其中所述的环I和/或环II经以下的手段修饰：插入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基，优选14-36个氨基酸残基。

12、如前述任一个权利要求所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被插入到树眼镜蛇毒素支架的氨基酸残基间，该残基选自2-16、21-36、21-31、28-32、9-13、21-33位中的一个或多个或第50位残基之后的树眼镜蛇毒素支架末端。

13、一种编码如权利要求1-12中任一项所述的多肽的核酸分子。

14、如权利要求13所述的核酸，可操纵地连接到一个启动子上，并且可任选连接到一段编码异源蛋白或肽的核酸序列上，从而编码一个融合产物。

15、如权利要求14所述的核酸，其中所述的启动子是IPTG诱导的启动子，任选地所述的异源蛋白或肽是谷胱甘肽S-转移酶。

16、一种含有如权利要求13-15中任一项所述的核酸的质粒。

17、含有如权利要求13所述的核酸的质粒pGEX-3X。

18、一种用如权利要求16或17中所述的质粒转化的宿主细胞。

19、如权利要求18所述的宿主细胞，其是大肠杆菌。

20、一种包含如权利要求18或19中所述的宿主细胞的细胞培养物。

21、一种生产如权利要求1-12中任一项所定义的多肽的方法，包括培养如权利要求18或19所述的宿主细胞以表达所述的多肽，从培养物中抽提该多肽，并纯化。

22、一种生产一种多功能抗凝剂的方法，包括：

a)构建一个表达载体，它包括编码树眼镜蛇毒素支架的核酸序列，可操纵地与一个启动子相连，且任选与编码异源蛋白质的核酸相连以便与其共表达；

b)通过插入、缺失或者取代一个或多个核苷酸残基，对编码树眼镜蛇毒素支架的载体的核酸序列中除结合血小板RGD基序之外的至少一个部分进行修饰，从而在表达时，树眼镜蛇毒素的支架中包括一个具有除树眼镜蛇毒素活性之外的活性的另外的氨基酸序列；

c)用上述载体转化宿主细胞，使该宿主细胞表达修饰的树眼镜蛇毒素核酸序列。