[发明专利]俘获测定法

权利要求书

1.一种测定样品中微生物和/或其细胞内物质的存在和/或含量的方法，其特征在于它包括：

(a)将样品暴露于一种固定化在固体基质上的俘获剂，该俘获剂能够与微生物或其细胞内物质相结合，从而使微生物或其细胞内物质与固体基质相关联，

(b)将固体基质暴露于能够使腺苷酸激酶与微生物和/或其细胞内物质相关联的试剂，这些微生物和/或其细胞内物质是易于与施加于基质上的溶液相作用的，

(c)将含有二磷酸腺苷(ADP)的溶液施加于基质，所用的条件使存在的任何腺苷酸激酶都能产生三磷酸腺苷(ATP)，

(d)测定产生的三磷酸腺苷(ATP)的量，并使之与微生物或细胞内含物的存在和/或含量相关。

2.权利要求1的方法，其中步骤(d)用一种包括生色反应的测定法来实现。

3.权利要求1的方法，其中实现步骤(d)的方法是：用虫荧光素酶/虫荧光素试剂产生与生成的ATP的量成比例的光，并用光度计测定所产生的光。

4.权利要求1、2或3的方法，其中用于步骤(c)的条件包括镁离子的存在，其摩尔浓度足以使ADP最大限度地转化成ATP。

5.权利要求4的方法，其中实现步骤(b)和(c)的方法是对样品加入提取剂、ADP和镁离子，并将此混合物温育一个预定的时间，以使ADP转化成ATP。

6.上述权利要求任一权项的方法，其中用于步骤(a)的俘获剂包含对微生物的一个属、种或对一类微生物具有特异性的固定化抗体，或者包含外源凝集素。

7.权利要求6的方法，其中俘获剂是一种用共价偶联或抗生蛋白链菌素/生物素相互作用而与固体基质相连的抗体。

8.上述权利要求任一权项的方法，其中固体基质能够被磁场吸住。

9.权利要求8的方法，其中步骤(a)可通过下述方法实现：向一个容器内加入其表面带有固定化抗体的磁性微珠，再加入溶液或悬液形式的待检样品，并进行搅拌，然后用磁场将带有俘获的微生物和/或物质的微珠固定，除去剩余的样品溶液或悬液，加入底物ADP和提取剂溶液或可使腺苷酸激酶易于与ADP溶液相作用的溶液，撤去磁场，并对在底物溶液中的微珠进行搅拌，再次施加磁场使微珠固定，转移出包含有ADP、提取剂和任何生成的ATP的溶液，并对其中的ATP进行测定。

10.权利要求1至7中任一权项的方法，其中的俘获剂是被保持在柱中的。

11.权利要求10的方法，其中的俘获剂被固定化在充装于柱中的微珠上。

12.权利要求11的方法，其中样品和检测试剂依次通过该柱，使生成的ATP流出并被测定，并使之与俘获剂靶物质的存在相关。

13.上述权利要求任一权项的方法，其中与被结合的样品相接触的ADP的含量，足以提供超过0.005mM的ADP浓度。

14.权利要求13的方法，其中ADP的含量足以提供大约0.1mM的ADP浓度。

15.权利要求13的方法，其中与被结合的样品相接触的镁离子的浓度是1mM或以上。

16.权利要求15的方法，其中镁离子的浓度是10mM或以上。

17权利要求1至16中任一权项的方法，其中步骤(b)是通过加入含有阳离子去污剂的试剂来实现的。

18.权利要求17的方法，其中的试剂含有叔二胺。

19.一种用于实施权利要求1至10中任一权项的方法的检测试剂盒，该试剂盒包含能够结合微生物或其细胞内物质的固定化俘获剂以及二磷酸腺苷试剂。

20.权利要求19的检测试剂盒，其还包含镁离子源和/或虫荧光素酶和虫荧光素。

21.权利要求20的检测试剂盒，其包含一种固定化在固体支持物上的抗体，这种支持物是松散的微珠形式，用微珠填充的柱子，或者是被包被的微量滴定孔，试剂盒内还包含纯度高于99.999％的ADP试剂，以及包含基本上没有腺苷酸激酶活性的BSA的虫荧光素酶/虫荧光素试剂。