[发明专利]化学发光方法和组合物

说明书

本发明涉及一种化学发光方法，该方法借助一种酶的作用由一种受护增强剂生成第二种酶的增强剂，而第二种酶本身又催化一个化学发光反应。本发明还涉及使用该方法来检测第一种酶。进一步，本发明涉及使用该方法对结合在第一种酶上的各种生物分子进行检测和定量。例如，该方法可借助免疫测定技术用来单独检测第一种酶或用第一种酶标记的半抗原、抗原和抗体;以Western印迹法检测蛋白质;分别以Southern印迹法和Northern印迹法检测DNA和RNA。该方法还可以在DNA顺序测定中用于检测DNA。

a.鲁米诺及有关化合物的化学发光氧化作用

氨基取代的环酰基酰肼，如鲁米诺和异鲁米诺，能够在碱性条件下与H₂O₂和过氧化物酶催化剂（如辣根过氧化物酶，简称HRP）反应而发光。该反应曾用作检测H₂O₂的分析方法及金属离子分析方法的基础。鲁米诺和异鲁米诺可以直接与所要检测的物质结合。用鲁米诺作标记物的第一个化学发光免疫试验，是由Schroeder报导的一种生物素测定法（H.R.Schroeder，P.O.Vogelhut，R.J.Carrico，R.C.Boguslaski，R.T.Buckler，Anal.Chem.，48：1933，1976）。从此便有了许多有关用鲁米诺衍生物作标记物应用的报导（H.R.Schroeder in Luminescent Immunoassays：Perspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry，M.Serio and M.Pazzagli，Eds.，Raven Press，New  York，pp129-146（1982）;M.Pazzagli，G.Messeri，A.L.Caldini，G.Monetti，G.Martinazzo，M.Serio，J.Steroid  Biochem.，19：407，1983;Bioluminescence  and  Chemiluminescence  New  Perspectives，J.Scholmerich，et  al，Eds.，J.Wiley  &  Sons，Chichester（1987））。还曾使用各种增强剂与鲁米诺合用以提高发光强度。这些增强剂包括D-荧光素（T.P.Whitehead，G.H.Thorpe，T.J.Carter，C.Groucutt，L.J.Kricka，Nature  305：158，1983）及对碘苯酚和对苯基苯酚（G.H.Thorpe，L.J.Kricka，S.B.Mosely，T.P.Whitehead，Clin.Chem.，31：1335，1985）。

b.酶催化的化学发光反应

1.稳定化1，2-二氧杂环丁烷的酶促触发。最近开发的热稳定性二氧杂环丁烷类，可以用化学方法或酶法触发，产生所需求的化学发光（A.P.Schaap，美国专利4，857，652;A.P.Schaap，R.S.Handley，B.P.Giri，Tetrahedron  Lett.，935（1987）;A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.DeSilva，B.P.Giri，Tetrahedron  Lett.，1155（1987）;A.P.Schaap，M.D.Sandison，R.S.Handley，Tetrahedron  Lett.，1159（1987））。这些二氧杂环丁烷类具有几个关键特征：（1）利用了螺环稠合的金刚烷基的稳定化影响，使二氧杂环丁烷类的“贮存寿命”在室温下达数年之久;（2）有一个富电子芳香基团，它使激发态得以有效产生，并在受到激发时发出荧光;（3）有一个保护基，该基团能防止化学发光分解作用，直到该基团由酶或其他化学反应脱除为止。

反应式1