[其他]用解脂亚罗威阿酵母转化株表达和分泌异源蛋白质

说明书

本发明涉及酵母蛋白的分泌技术，尤其涉及重组解脂亚罗威阿酵母（Yarrowia    lipolytica）克隆载体，包括为哺乳动物蛋白质（例如凝乳酶原）和其他多肽的表达和分泌的异源DNA编码;涉及表达载体，包括解脂亚罗威阿酵母基因启动子（例如XPR2或LEU2）、碱性蛋白酶信号（或前顺序、前区域、XPR2终止密码子区域，以及由于遗传密码简并性或使用其它解脂亚罗威阿酵母基因成分产生的变异体及其功能相同者。此外，本发明还涉及携带所述表达载体和分泌载体的酵母转化株，他们被用于产生天然功能状态的异源蛋白质;以及完成上述的各项方法。

稳定而又充分地提供对工业（例如凝乳酶原、牛生长激素）或医用（例如尿抑胃激素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、人体过敏毒素C5a）有着重要价值的各种蛋白质或多肽，特别是提供可以作为易于获得的有作用的优质产品的原料，这种经济上的诱惑力，导致许多发明者把DNA重组体技术应用于作为生产异源蛋白质“工厂”的微生物。

由于从重组体宿主细胞的胞内积累中特别是从大肠杆菌中重新获得具有生物活性的外源的或异源的（外来的）蛋白质存在着有可能解决困难的方法，所以进一步的研究集中在蛋白质的分泌上。在大肠杆菌中，异源蛋白质往往是以可折射光的包涵体的状态在细胞内产生的。该蛋白质通常水溶性很低，而且很少有或者没有生物活性。从可折射光的包涵体中提取该蛋白质通常包括苛刻的化学处理，这种处理可能花费昂贵而重新获得所需的天然的有生物活性的蛋白质都是微乎其微或者一无所获。此外，该蛋白质带有由大肠杆菌产生的不希望要的物质，为了释放可折射光的包涵体，需要破坏细胞，因而污染的可能性也随之剧烈增加。除了大肠杆菌外，其它微生物也能产生不溶性胞内状态的异源蛋白质，例如1982年7月28日公布的英国专利2，091，271号，公开了用DNA重组体技术表达牛犊凝乳酶的啤酒酵母（S.cerevisiae）的遗传修饰，凝乳酶的两个英文术语rennin和Chmosin可以交换使用。鉴于这些困难，从宿主微生物分泌该种蛋白质已转向力图产生具有天然活性构型的蛋白质。

一种特殊的蛋白质，包括异源蛋白质或多肽是否可由特定的微生物分泌，看来似乎决定于蛋白质。在大多数真核细胞中，有的蛋白质合成装置是与内质网膜和在初生多肽链的氨基端附近的氨基酸顺序（称为“信号顺序”）有关，该链的作用是操纵蛋白穿过内质网膜。接着在提供具有活性的成熟的蛋白质的分泌过程中，用水解蛋白质切开信号顺序。已经做出的某些尝试，目的是为了包括枯草杆菌、啤酒酵母和培养中的哺乳动物细胞，用微生物中的信号顺序，发展分泌异源蛋白质的方法。然而所述的这些微生物尚未证明是合乎理想的。

枯草杆菌的固有特性，例如分泌许多蛋白质，包括趋于会分解已被分泌的异源蛋白质的许多蛋白酶;已被转化的菌株由于失去异源DNA而造成不稳定性也阻碍了它的产生。

从遗传学角度已经成功地完成了哺乳动物细胞表达和分离异源蛋白质，但是，这些系统都有技术上的要求，并且费用很高，要把大多数蛋白质作为产品进行商业生产仍然是不切实际的。

虽然啤酒酵母作为蛋白质分泌系统有其某些固有的局限性，但另一方面，蛋白质分泌研究在啤酒酵母上取得的成功都超过枯草杆菌。1984年10月31日公布的欧州专利申请0123544号，介绍了啤酒酵母α因子基因的分离，并且将启动子和/或其信号肽部分与编码异源蛋白质的DNA相结合，应用到酵母的质粒上，使酵母细胞在细胞培养基上能够产生成熟的单一蛋白质。1983年9月14日公布的欧洲专利申请0088632号，介绍了表达和分泌啤酒酵母异源蛋白质的方法。可是啤酒酵母以这些或另一些分泌系统进行有效分泌的这些蛋白质的大小看来似乎限于20，000道尔顿左右。克服啤酒酵母作为分泌微生物的这种普遍性的低效率正如Smith等所介绍的，要求多重突变体（Science    229;1219～1224（1985））。对这种趋向的一个例外就是研究大于20000道尔顿的曲霉属（Aspergillus）酶类，看来这类酶可以用啤酒酵母分泌，但是被其强烈糖基化，这可能影响分泌的效率。