[其他]用重组DNA技术制备DNA、RNA、肽、多肽或蛋白质的方法

说明书

本发明的目的是一种获得DNA、RNA、肽、多肽或蛋白质的程序，用含有能够表达这些RNA、肽、多肽或蛋白质的基因的转化的宿主细胞，即利用重组DNA技术实现。

本发明的目的在于以一种可以同时获得的方式产生随机基因或随机基因碎片，这些基因转录和转译之后，大量（至少约为10，000）全新蛋白质或与已知蛋白质的杂化物在含有能够表达这些蛋白质的基因的宿主细胞（细菌或真核的）的存在下产生，并且为了确定它们中的哪一种产生具有新要求特性的蛋白质，随后在上述无性繁殖系中进行筛选，其性质有如结构的，酶的、催化的、抗原的、药理的或配体的特性，以及更一般的化学、生化、生物学等特性。其次本发明的目的在于通过修饰上述随机因或其产物而改进所要求的功能。

同样，本发明的目的表明了获得且随之改进具有可利用的显著的化学、生化或生物学特性的DNA或RNA序列的方法。

因此，本发明显然可供科学、工业和医学上的许多方面的大量应用。

根据本发明，肽或多肽的制备方法的特征是它在同一培养基中同时产生了至少部分是由合成随机多聚核苷酸的构成的基因，它将这样获得的基因导入宿主细胞，同时培养了含有如此基因的转化宿主细胞的独立无性系，因而无性繁殖了随机基因并获得了通过这些随机基因的每一个所表达的蛋白质产物，它以鉴别那些产生了具有至少一种所要求特性的肽或多肽的无性系的方式选择和/或筛选转化的宿主细胞无性系，随之将这样鉴定出的无性系分离出来并培养之，使它们产生至少一种具有所述特性的肽或多肽。当所要求特性需要改进时，该方法包括对产生已确定肽的基因的修饰，继之以上述基因的再次无性繁殖，并选择或筛选转化细胞以确定那些产生至少一种具有改进功能的肽或多肽的细胞。它也包括蛋白质生产物本身的修饰。

利用本技术的首要的方法为，通过四种脱氧磷酸核苷酸A、C、G和T从一个起始线性表达载体的两端的随机共聚产生随机基因，随后以这样的方式合成粘性末端以便形成由一分子具有两个3′末端是互补的随机序列的表达载体所构成的随机起始单链DNA，随之合成随机DNA的副链。

利用本技术的另一方式为，通过没有粘性末端的寡核苷酸的共聚产生随机基因，采用合成随机DNA碎片的方式，然后将这些碎片连到预先线性化的表达载体上。

表达载体可以是一个质粒，显著的是细菌质粒。应用pUC8质粒作为表达载体已经获得了极好的结果。

表达载体也可以是病毒DNA或者质粒与病毒DNA的杂化物。

宿主细胞可以是原核细胞，如HB101和C600，或者是真核细胞。

当应用上述第二种方式的技术时，能够利用形成了一组回文八聚体的寡核苷酸。

利用下述回文八聚体取得了极好的结果：

5′GGAATTCC    3′

5′GGTCGACC    3′

5′CAAGCTTG    3′

5′CCATATGG    3′

5′CATCGATG    3′

还能够应用形成一组回文七聚体的寡核苷酸。

应用下列回文七聚体取得了好结果：

5′XTCGCGA    3′

5′XCTGCAG    3′

5′RGGTACC    3′

此处X＝A、G、C或T、R＝A或T

按照利用这些特别有利的技术的方法，可以从一转化宿主细胞的独立无性系培养物中分离并提纯质粒的转化DNA，转化宿主细胞按上述方法获得，经后用至少一种对应于在回文八聚体或七聚体上所表现出来的而在所用表达载体上所没有的特异限制切割位点的限制性内切酶切割这些质粒;切割后将限制性内切酶钝化，然后同时用T₄DNA连接酶处理这样获得的线性随机DNA碎片的群体，以这样的方式得到了含有随机序列的新的一套DNA，由此这个新群体含有比在起始群体中的基因数量更大的随机基因量。然后用这批新的转化DNA转化宿主细胞并无性繁殖这些基因，最后选择和（或）筛选并分离转化宿主细胞的新无性系并培养之以生产至少一种肽或多肽，例如，一种新型的具有所要求特性的蛋白质。

任何其它的用以产生并无性繁殖随机DNA序列以使其表达为新肽、多肽或蛋白质，或表达为融合蛋白质的新部分，继之以筛选或寻找所要求特性并获得至少一种产生具有所要求特性的肽的无性系的方法，都能够根据本发明而应用。

作为选择宿主细胞无性系标准的特性可为由给定无性系所产生的肽或多肽催化给定化学反应的能力。

进而，对于几种肽和（或）多肽的生产来说，上述性质可为催化一系列反应的能力，这些反应将一组起始化合物变成至少一种目标化合物。