[发明专利]一种痘病毒载体疫苗的制备方法

说明书

本发明提供一种痘病毒载体疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1：制备原代鸡胚细胞悬液；S2：痘病毒培养；将含有0.1~0.5%人血白蛋白和0.1~1.0 mmol/L谷氨酰胺二肽的无血清培养基注入一次性反应袋中，加入细胞悬液，混匀；将病毒感染增强剂加入无血清培养基中，加入病毒悬液，混匀，4℃静置后，将病毒悬液加入至反应袋中，混匀培养；S3：痘病毒收获。本发明的制备方法采用一次性反应器培养，该系统以片状载体作为原代鸡胚细胞的支撑，无需灭菌，操作简便，产量高；加入病毒增殖剂增加了病毒的感染力，减少病毒接种量；采用无血清培养基培养，产品纯度高，无血清残留。

技术领域

本发明涉及疫苗领域，特别涉及一种痘病毒载体疫苗的制备方法。

背景技术

痘病毒作为预防天花的疫苗，在我国大量人群中长期使用，具有非常好的安全性，重组病毒载体疫苗具有插入外源基因长、接种途径多、能诱导体液免疫和细胞免疫反应及易生产制备等优点，且能克服传统疫苗的某些弊端，能极大地提高疾病的预防性，已在疫苗研制中得到了广泛的应用。以重组痘病毒作为表达载体制成的预防性疫苗已开展多项临床试验，重组病毒载体疫苗具有插入外源基因长、接种途径多、能诱导体液免疫和细胞免疫反应及易生产制备等优点，且能克服传统疫苗的某些弊端，能极大地提高疾病的预防性，已在疫苗研制中得到了广泛的应用。

痘病毒载体类疫苗常采用含有血清的培养基，有血清残留风险，收获的原液含有较多细胞碎片，且牛血清的残留量也较多，因此产品的纯度并不高；常在细胞转瓶或细胞工厂培养，然后经冻融过滤后即为病毒液，该工艺的人工操作多，容易污染，劳动强度大，占地面积多；该工艺产品的培养效率低，采用的MOI（每个细胞感染的病毒数）较高，耗费病毒量多。因此，目前亟需一种操作简便、不易污染、产量高、纯度高的痘病毒载体疫苗制备方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种痘病毒载体疫苗的制备方法。

本发明提供一种痘病毒载体疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1：制备原代鸡胚细胞悬液；

S2：痘病毒培养；

将含有0.1~0.5%人血白蛋白和0.1~1.0 mmol/L谷氨酰胺二肽的无血清培养基注入一次性反应袋中，一次性反应袋放在摆床反应器中使用，加入细胞悬液，混匀；将病毒感染增强剂加入无血清培养基中，加入病毒悬液，混匀，4℃静置后，将病毒悬液加入至反应袋中，混匀；培养18小时后，灌流培养，培养至68~82小时，终止培养；人血白蛋白和谷氨酰胺二肽的作用是为细胞提供营养，提高细胞活性。

S3：痘病毒收获；

终止培养后，弃上清，用PBS清洗后，加入保护剂至-80℃冻结后，在室温溶解，收集溶液，离心收获上清液即为痘病毒原液。

进一步的，所述步骤S1的具体步骤如下：

取发育9~11日龄的鸡胚，去头，剪碎，用胰酶消化，加入等体积含血清的培养基中和胰酶，离心去上清，加入培养基吹打分散细胞，收集悬液即为原代鸡胚细胞悬液。

进一步的，所述步骤S2中所述一次性反应袋中装有30 g/L的片状载体。

进一步的，所述步骤S2中将含有人血白蛋白和谷氨酰胺二肽的无血清培养基注入一次性反应袋后，按照1~5×10⁶个细胞/mL加入细胞悬液。

进一步的，所述步骤S2中将病毒感染增强剂加入无血清培养基中，并按0.001~0.01 MOI加入病毒悬液。

进一步的，所述步骤S2中所述4℃静置后，将病毒悬液加入至反应袋中，混匀，培养条件为37±1℃、角度7°、溶氧70%±20%、pH 7.6±0.1。

进一步的，所述步骤S3中保护剂为1~5%质量体积比的蔗糖。

本发明还提供所述的制备方法制备得到的痘病毒载体疫苗。