[发明专利]用于生产L-缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了用于生产L‑缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明发现将大肠杆菌中的ycgH基因敲除并表达ilvC后，或者结合敲除yjiT基因与表达brnF与brnE，敲除yjiV基因与表达ilvE与ilvD，敲除trpR基因与表达ilvH突变蛋白，敲除lacI与lacZ基因与表达DNA聚合酶，所得重组菌可提高L‑缬氨酸产量，可用于生产L‑缬氨酸，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，用于生产L-缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

在微生物中，L-缬氨酸(支链氨基酸的一种)是从丙酮酸开始，经由乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸生物合成的。通过乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B催化的反应产生这些中间代谢产物。然而，这些酶还参与从丁酮酸和丙酮酸开始的L-异亮氨酸的生物合成，而且L-亮氨酸也从酮异戊酸(一种中间代谢产物)开始，经由2-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸和酮异己酸生物合成。因此，因为支链氨基酸(即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸)使用相同的酶用于其生物合成过程，所以已知工业上通过发酵生产一种类型的支链氨基酸具有难度。此外，存在的一个问题是工业的批量生产受到由L-缬氨酸(其为终产物)或其衍生物引起的反馈抑制的限制。

大肠杆菌具有明确的遗传背景，是氨基酸生产中具有吸引力的工业化生产底盘。然而，相比于谷氨酸棒杆菌，生产L-缬氨酸的大肠杆菌菌株的相关报道较少，这可能是由于大肠杆菌对L-缬氨酸生物合成的调节机制更为复杂。乙酰羟基酸合酶(AHAS)是L-缬氨酸生物合成的限速酶，大肠杆菌有三种AHAS同工酶，由ilvBN、ilvGM和ilvIH编码，具有不同的性质和调节机制。Park等人报道了通过Escherichia coli W3110和Escherichia coli W的系统代谢工程改造L-缬氨酸生产菌株，其L-缬氨酸终产量达到60.7g/L，糖酸转化率为0.22g/g。除了诱变育种和常规代谢工程修饰外，辅因子平衡也被认为是提高L-缬氨酸产量的关键瓶颈。由于胞内辅因子影响代谢网络、信号转导和物质运输，进而影响微生物细胞的生理功能。在微生物发酵生产化学品的过程中，化学品的效价和产量往往受到辅因子不平衡的限制，这主要是由合成途径中辅因子依赖酶的不平衡表达引起的。Savrasova和Stoynova等人通过用异源NADH依赖性亮氨酸脱氢酶替换天然NADPH依赖性转氨酶，构建了一株以大肠杆菌MG1655为出发菌株的L-缬氨酸工程菌。在微需氧条件下，该菌株的糖酸转化率(0.23g/g)仅为最大理论产量0.65g/g的35.4％。开发生物传感器高通量筛选方法，引入外源辅酶再生途径以平衡胞内辅因子，构建高效的工业底盘生产菌株，是需要解决关键科学问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高L -缬氨酸产量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于生产缬氨酸的工程菌，所述工程菌为对受体菌进行改造得到的重组菌；所述改造包括A5）；

A5）包括A51）和A52）：

A51）敲除所述受体菌的ycgH基因，抑制所述ycgH基因的表达或抑制所述ycgH基因编码的蛋白质的活性；

A52）增加所述受体菌中ilvC基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvC基因编码蛋白质的活性。

其中，所述受体菌含有ycgH基因（GeneID:2847703，更新日期2023-04-14）。

上述工程菌中，所述ilvC基因可来源于大肠杆菌（ Escherichia coli）。

上述工程菌中，所述ilvC基因可编码序列表中SEQ ID No.12所示的蛋白质。

上述工程菌中，所述ilvC基因可为序列表中SEQ ID No.11的第794-2269位所示的DNA分子。