[发明专利]一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体、构建方法、工程菌及应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体、构建方法、工程菌及应用，包括大肠杆菌质粒载体骨架，所述质粒载体骨架上组装连接有大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1核苷酸片段和大肠杆菌内源DNA解旋酶DnaB核苷酸片段，所述rAPOBEC1核苷酸片段和DnaB核苷酸片段之间通过柔性连接肽linker核苷酸片段连接。本发明提供的基因编辑质粒载体能够高效的辅助大肠杆菌自适应进化，可以将大肠杆菌基因组上的任意位点的胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，实现基因组高频率随机突变，帮助菌株在逆境环境中耐受进化。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体、构建方法、工程菌及应用。

背景技术

大肠杆菌又称大肠埃希氏菌，是一种实验室常用的原核生物，属于革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚、培养条件简单、适合大规模发酵，是应用最广泛、最成功的生物制造底盘菌株。在大肠杆菌代谢工程改造的应用过程中，中间代谢产物及终产物的反馈抑制和毒性，如L-丝氨酸、2-酮丁酸等，限制了在相关领域的工业化推进速度。

为突破以上限制，近年来，适应性实验室进化(Adaptive Laboratory Evolution，ALE)逐渐被学者们关注。ALE是在实验室条件下，人工模拟自然进化中的变异和选择过程，借助人工选择压力实现微生物的定向进化，并从进化群体中筛选优良性状个体的一种方法。在ALE实验中，进化源自微生物本身自然突变或人工施加诱变(如紫外诱变等)，微生物为保持自身基因组完整性，细胞内存在严格错配修复机制，用以消除复制和重组事件中产生的错配区域，大大降低基因突变率，因此，进化周期通常较长，从几个月至数年不等，进化时间越长，传代培养过程中越容易出现染菌现象，进而导致实验失败。也有研究开展代谢途径改造辅助的适应性进化，如针对菌株对天然碳源利用能力或特定酶活性，首先通过对菌株代谢途径的理性改造，将菌株与目标底物利用能力或特定酶的催化活性与细胞生长速度耦联，再结合适应性进化获得理想的突变株或突变体。该方法前期聚焦途径的建立，随后恢复到ALE的操作流程。此外，当需要进化的表型难以与细胞生长相关联时，可采用报告系统将目标表型转化为易于检测和筛选的信号，实现高通量和高选择性的进化，加快菌体表型的提升速度。一般来说，荧光信号易于检测，也可通过流式细胞仪进行高通量筛选，是目前最常用的报告系统。但该系统需要基于目标产物能够有相应的响应蛋白/元件，因此使用具有一定局限性。

文献Helicase-AID:A novel molecular device for base editing at randomgenomic loci将大肠杆菌DnaB与激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)融合，形成酶复合物，在整个染色体中随机引入编辑的碱基，发现DnaB-AID相对于野生型的诱变频率显著增加，为随机高效突变奠定了良好的参考基础。而多款脱氨酶耦联CRISPR-Cas9定点编辑系统的编辑窗口、靶点和效率差异，说明不同脱氨酶具有自身的特异性。当前，采用随机碱基编辑系统进行适应性进化筛选的应用尚未普及，主要局限于该系统种类选择性少，亟需拓展新型的随机编辑系统，从而加速该系统在代谢工程中的应用。

发明内容

本发明基于现有技术中存在的问题与不足，提供了一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体、构建方法、工程菌，并将其应用于辅助大肠杆菌自适应进化，缩短筛选周期，以克服现有技术中存在的大肠杆菌进化周期通常较长的问题。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明的第一个目的在于，提供了一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体，包括大肠杆菌质粒载体骨架，所述质粒载体骨架上组装连接有大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1核苷酸片段和大肠杆菌内源DNA解旋酶DnaB核苷酸片段，所述rAPOBEC1核苷酸片段和DnaB核苷酸片段之间通过柔性连接肽linker核苷酸片段连接；