[发明专利]一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体、构建方法、工程菌及应用

权利要求书

1.一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体，其特征在于，包括大肠杆菌质粒载体骨架，所述质粒载体骨架上组装连接有大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1核苷酸片段和大肠杆菌内源DNA解旋酶DnaB核苷酸片段，所述rAPOBEC1核苷酸片段和DnaB核苷酸片段之间通过柔性连接肽linker核苷酸片段连接；

其中所述rAPOBEC1核苷酸片段如SEQ ID NO.2所示，所述DnaB核苷酸片段如SEQ IDNO.4所示，所述linker核苷酸片段如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9之一所示。

2.如权利要求1所述的一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体，其特征在于，所述linker核苷酸片段如SEQ ID NO.6所示。

3.如权利要求1或2所述的一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体，其特征在于，还包括组装连接在所述质粒载体骨架上的启动子和终止子。

4.如权利要求3所述的一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体，其特征在于，所述启动子为Trc启动子，所述终止子为rrnB终止子，所述Trc启动子的核苷酸片段如SEQ ID NO.10所示，所述rrnB终止子的核苷酸片段如SEQ ID NO.11所示。

5.如权利要求1所述的一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体，其特征在于，所述质粒载体骨架为pTrc99a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种用于构建权利要求1～5中任意一项所述的辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以pTrc99a作为质粒载体骨架，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以人工合成的rAPOBEC1核苷酸片段为模板，通过引物扩增得到rAPOBEC1-linker核苷酸片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(3)以大肠杆菌基因组为模板，通过引物扩增得到dnaB片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；

(4)采用Gibson组装技术将步骤(1)～(3)中获得的核苷酸片段连接，构建得到辅助自适应进化的基因编辑质粒载体pTrc99a-rAPOBEC1-linker-dnaB，记为pAALE，其核苷酸序列如其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的引物为rAPOBEC1-F、rAPOBEC1-R，所述步骤(4)中的引物为dnaB-F、dnaB-R。

8.一种基因工程菌，其特征在于，由权利要求1～5中任意一项所述的辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体或者权利要求6或7所述的方法构建得到的辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体转化宿主菌所得。

9.如权利要求8所述的一种基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌W3110、DH5α、BL21菌株中的一种。

10.权利要求求1～5中任意一项所述的辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体或者权利要求6或7所述的方法构建得到的辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体或者权利要求8或9所述的基因工程菌在大肠杆菌自适应进化中的应用。