[发明专利]细胞模型及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种细胞模型的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

采用CRISPR/Cas9系统将YFP编码基因的序列定点敲入至正常肝细胞系的p21基因中，得到重组细胞；

在所述重组细胞中，筛选出p21-YFP阳性细胞，获得细胞模型。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述筛选出p21-YFP阳性细胞的步骤前，还包括用含有药物的培养基诱导培养所述重组细胞衰老的步骤；

可选的，所述药物包括Doxorubicin、Aphidicolin、Hydroxyurea、Etoposide、Decitabine、Trichostatin A、MS-275和Palbociclib中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述药物为Doxorubicin，所述Doxorubicin在培养基中的浓度为20nM～100nM；

可选的，所述药物诱导培养的时间为1天～7天，诱导培养后更换正常培养基继续培养3天～4天。

4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9核酸酶和/或靶向p21基因的gRNA；

可选的，所述gRNA的正向序列和反向互补序列分别如SEQ.ID No.1所示和SEQ.IDNo.2所示。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述定点敲入包括将所述CRISPR/Cas9系统和包含YFP编码基因的同源重组载体转染至所述正常肝细胞系中，得到所述重组细胞的步骤。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述同源重组载体包含如下DNA片段：5’端同源臂、YFP编码基因及3’端同源臂；

所述5’端同源臂为位于所述p21基因的终止密码子位置到上游的长度为700bp-1000bp序列，所述3’端同源臂为位于所述p21基因的终止密码子位置到下游的长度为700bp-1000bp序列；

可选的，所述5’端同源臂的序列为SEQ.ID No.13所示的第2636位～第3505位的碱基，所述YFP编码基因的序列为SEQ.ID No.13所示的第3536～第4252位置的碱基，所述3’端同源臂的序列为SEQ.ID No.13所示的第5138～第5980位置的碱基。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述同源重组载体还包含抗性筛选标志的序列；

可选的，所述抗性筛选标志包含新霉素、卡大霉素或卡那霉素中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述同源重组载体的构建方法，包括如下步骤：

以含有SEQ.ID No.13所示的的第5138～第5980位置的碱基序列的质粒为模板，分别以SEQ.ID No.5～6和SEQ.ID No.9～10为引物，扩增得到产物Vector片段和YFP-Neo片段；

以LO2细胞基因组DNA为模板，分别以SEQ.ID No.7～8和SEQ.ID No.11～12为引物，扩增得到产物5’端同源臂的序列和3’端同源臂的序列；

采用Gibson法将所述5’端同源臂的序列、所述3’端同源臂的序列、所述Vector序列和所述YFP-Neo序列组装，获得所述同源重组载体；

可选的，所述同源重组载体的序列为SEQ.ID No.13所示。

9.权利要求1～8任一项所述制备方法制备得到的细胞模型。

10.权利要求9所述细胞模型在制备抗衰老药物的筛选系统或药物的促衰老副作用的评价系统中的应用。