[发明专利]一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测引物、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测引物和方法，属于病毒检测技术领域。本发明所述引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物；本发明的检测方法可对新型鹅星状病毒CHSH01进行检测，具有稳定性好、特异性强、重复性好、定量准确的优点，对CHSH01的最低检出浓度为1×10supgt;2/supgt;copies/μL，达到了普通PCR的100倍，能够高效地检测出感染或携带CHSH01株的雏鹅，有助于及时防治。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测引物、试剂盒和方法，特别涉及一种新型鹅星状病毒毒株的实时荧光定量PCR检测引物、试剂盒和方法。

背景技术

星状病毒是一种无包膜的单正链RNA病毒，可引发人和动物的肠道疾病，是引起幼儿，老年人以及免疫力低下者病毒性肠炎的主要病原之一。星状病毒分布广泛，通过粪-口途径传播，可以引起人类和包括鸡，鸭，鹅，蝙蝠，犬，野鸟等多种动物在内的疾病，其致病性逐渐受到重视。

鹅源星状病毒(GooseAstrovirus，GoAstV)是国内近年来多发的传染病原之一，该病毒主要感染3周龄以内的雏鹅，患病雏鹅表现为食欲不振，精神萎靡，关节肿大，瘫痪等症状，死亡率很高，对我国的养殖业造成了巨大的危害。2020年3月，上海某鹅场发生鹅痛风病爆发，症状与星状病毒感染类似，随机采集7只死亡雏鹅的肝脏、肾脏和粪便样本，通过宏基因组学方法构建样本文库进行高通量测序，对测序结果进行生物信息学分析后发现了一株鹅源星状病毒的新型毒株CHSH01(GenBank no.OM569656)，该病毒的基因组全长为7330nt(不包括polyA尾巴)，与其他星状病毒的相似性很低，尤其是ORF2区，相似度仅为45.3％。系统发育分析和重组分析表明CHSH01可能代表禽星状病毒属的一个新物种，并且是一株重组毒株，其亲本之一为来自迁徙鸟斑头雁的星状病毒(GenBank no.MT138004)。

目前，针对鹅源星状病毒的检测方法大多依赖于分子生物学诊断方法，而其中又以传统PCR方法最为常用，但是该方法具有无法定量，灵敏度低等缺点。实时荧光定量PCR检测方法凭借其灵敏度高，特异性强，定量准确，快速检测等优点已经在基因表达水平和病原体的定量检测等方面中得到了广泛的应用。之前报道的实时荧光定量PCR均是针对老的毒株，无法检测上述的新毒株。本发明针对鹅源星状病毒的新型毒株建立有效的实时荧光定量PCR检测方法能够填补技术上的空白，有助于及时阻断该病毒的传播，对养殖业的发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种新的鹅星状病毒检测引物和检测方法，针对鹅源星状病毒新型毒株的实时荧光定量PCR检测引物和方法，以实现对该病毒进行快速有效，特异性强，灵敏度高的定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供一种鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测引物，所述引物序列如下：

NGAstV-F：5’-GACATATTTGCGCACGGTCC-3’(SEQ ID NO.1)，

NGAstV-R：5’-TTACGAGCTGCACGGATGTT-3’(SEQ ID NO.2)，

目的片段大小为185bp；

进一步的，所述鹅源星状病毒为CHSH01(GenBank NO.OM569656)。

本发明还提供一种鹅星状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括所述鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测引物；所述试剂盒还包括标准品和荧光定量PCR反应试剂，所述荧光定量PCR反应试剂包括SYBR Green Mix。

所述标准品的制备方法如下：

设计标准品扩增引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：