[发明专利]硬毛粗盖孔菌内参基因及其引物和应用

说明书

本发明公开了硬毛粗盖孔菌内参基因及其引物和应用。所述的内参基因包括泛素结合酶1、自噬蛋白Atg8、泛素结合酶2、钙调磷酸酯酶和真菌蛋白激酶基因。本发明所公开的5个内参基因分别适用于不同表达水平基因的表达量研究。本发明所提供的内参基因在不同的发育时期和不同的培养条件下均具有稳定的表达，且内参引物特异性强、扩增稳定、扩增效率均接近100％。此外，可以根据目的基因的表达水平，在这5个内参基因中选择合适的内参基因进行表达量研究。为硬毛粗盖孔菌基因表达研究提供了比常见的内参基因如gapdh更稳定的、更广泛的新候选内参基因。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及适用于硬毛粗盖孔菌生长发育、碳源利用、高温生长研究的内参基因及其引物和应用。

背景技术

实时荧光定量PCR(qPCR)因其高灵敏度、特异性和可靠性，已经成为研究基因表达量的重要工具。然而，qPCR分析的有效性很大程度上取决于内参基因的选择和引物的设计。因此，筛选在不同条件下表达相对稳定的基因作为内参基因设计引物，是qPCR成功与否的关键所在。

在前期的研究中，我们使用传统的内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为硬毛粗盖孔菌基因表达量研究的内参基因。然而gapdh的表达也会受到某些因素的影响，且gapdh的表达量较高，在对低表达基因进行研究时，适用性较差。目前，还未有针对硬毛粗盖孔菌不同培养条件和发育过程内参基因及其引物的系统研究。

准确的基因序列是引物设计和正确扩增的前提条件，现有的基因注释软件通常是基于已有的模型进行基因结构的预测，然而不同物种甚至不同品种的基因结构有可能存在较大的差异，因此依据转录组数据对基因结构进行校正获得准确的基因信息具有重要的意义。

由于引物序列一般为18-22bp的短核苷酸序列，在基因组中存在大量相似的碱基位点，容易造成非特异性扩增。传统使用实验方法进行逐一验证引物特异性的方法，耗时长、效率较低、成本高。因此，引物合成前基于全基因组序列进行BLAST，去掉具有潜在多个结合位点的引物，可大大降低引物的筛选工作，提高引物筛选效率。

发明内容

本发明的目的是筛选适用于硬毛粗盖孔菌不同研究情景、不同基因表达水平的内参基因及引物。本发明所使用的筛选方法简单、快捷，筛选出了扩增效率高、稳定性好的硬毛粗盖孔菌内参基因引物。

本发明的第一个目的是提供硬毛粗盖孔菌的内参基因，所述的内参基因包括泛素结合酶1、自噬蛋白Atg8、泛素结合酶2、钙调磷酸酯酶和真菌蛋白激酶的基因；泛素结合酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；自噬蛋白Atg8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；泛素结合酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；钙调磷酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；真菌蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

泛素结合酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

ATGGCCCTCAAGCGCATTAACAAGTTAATCGATCTCGGCCGGGACCCGCCCTCCTCGTGCAGCGCA

GGCCCAACTGGCGATAACATGTTCCAGTGGCAAGCAACGATCATGGGACCGGCGGATTCACCATAC

GCTGGTGGCGTGTTCTTCCTGTCTATCACTTTCCCCACGGACTACCCCTTCAAGCCGCCCAAGGTCA

GCTTCACGACCAAGATCTACCACCCGAACATCAACGCGAACGGGTCGATCTGTCTCGATATCCTGA

GGGACCAGTGGAGTCCAGCATTGACTATCTCGAAAGTTCTGCTTTCGATTTGCTCAATGCTCACGGA