[发明专利]脆弱拟杆菌及脆弱拟杆菌BFS17的特异性新分子靶标及其快速检测方法

说明书

本发明公开了脆弱拟杆菌及脆弱拟杆菌BFS17的特异性新分子靶标及其快速检测方法。所述的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的分子靶标核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的脆弱拟杆菌BFS17的分子靶标核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用泛基因组方法获得脆弱拟杆菌及益生菌株脆弱拟杆菌BFS17的特异性核心基因，设计获得能灵敏检测脆弱拟杆菌及益生菌株脆弱拟杆菌BFS17的特征引物，同时该方法能快速、简便地区分脆弱拟杆菌、益生菌株脆弱拟杆菌BFS17及其它微生物菌株。本发明具有操作简便快捷、特异性高、可定量、检测费用低廉的优点。

技术领域

本发明属于微生物技术领域以及医药技术领域，具体涉及脆弱拟杆菌及脆弱拟杆菌BFS17的特异性新分子靶标及其快速检测方法。

背景技术

拟杆菌是人体最常见的共生菌群，广泛定殖于人体的肠道、口腔、呼吸道和生殖道，与人类健康密切相关。在拟杆菌属的78个种及5个亚种中，又以脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)对人体健康的影响最大。脆弱拟杆菌是一种革兰氏染色阴性、短杆状、有荚膜、无芽孢、专性厌氧的微生物，该菌能分解蛋白胨、葡萄糖，产生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等多种物质，参与人体内的碳水化合物发酵、含氮类物质利用以及胆汁酸、类固醇的生物转化。一方面，脆弱拟杆菌可以协助人体产生微生物K、调节免疫，促进机体健康；另一方面，部分脆弱拟杆菌可能携带毒素编码基因，产生脆弱拟杆菌毒素(Bacteroides fragilis toxin,BFT)，引起宿主产生腹泻等症状。其中，发明人前期在我国健康人体肠道分离获得一株脆弱拟杆菌BFS17(GDMCC 63172)，该菌能高产GABA，高效缓解肠道炎症、增强肠道屏障功能、改善肠源性焦虑抑郁，具有良好的应用前景。因此，精准、灵敏地检测脆弱拟杆菌尤其是脆弱拟杆菌BFS17的存在、开展脆弱拟杆菌及脆弱拟杆菌BFS17的定量分析，具有重要的应用意义。

目前，脆弱拟杆菌的检测主要有基于分离培养后的形态学检测、生化试验等。这些方法需要对样本在厌氧条件下进行富集与选择性培养、在获得单菌落后进行显微镜下检查或系列的生化鉴定，实验耗时长、操作繁复、成本高，不利于对脆弱拟杆菌早期识别与鉴定，亦不能进行准确定量分析。近年来，以聚合酶链式反应PCR为基础的分子生物学检测以其快速、简便、准确、费用低等特点，已逐步取代传统培养及生化检测，成为微生物的最具潜力的新型检测技术之一。基于PCR的新型分子检测方法的关键是寻找该物种微生物特有的核苷酸序列进行检测设计。目前虽然有部分专利涉及了脆弱拟杆菌的分子检测方案，但主要仍基于该菌16S rRNA基因等微生物通用基因组中特异的序列进行引物设计。就脆弱拟杆菌而言，这些方案虽然能很好地区分脆弱拟杆菌与常见微生物如大肠杆菌的差别，但却较难区分脆弱拟杆菌与其近源微生物如单形拟杆菌、多形拟杆菌等。而目前对于具有良好益生作用的脆弱拟杆菌BFS17，亦无特异识别或快速定量的检测方式。

2005年，Tettelin等学者提出了微生物泛基因组的概念(pangenome)，泛基因组指的是某一物种全部基因的总称。在某一物种的泛基因组中，该物种的基因可分为三类，即核心基因(core genome)，指在所有株系中都保守存在的基因；非必须基因组(dispensablegenome)，指存在于部分个体中的基因，这些基因与物种的分化有关，在群落中赋予个体竞争优势；株特异基因(strain-specific genes)，指特异存在于某个个体中的基因。研究者采用高性能计算器，从全球公共数据库以及研究者自建数据库中采集某一物种的所有全基因组信息，通过Prokka、Roary等软件进行计算分析，可高效获得该物种的泛基因组及核心基因组信息。应用某一物种的核心基因，比对数据库内其他物种，则可获得该物种特异的核心基因。根据该物种特异的核心基因设计检测引物，已成为更精准的微生物检测方式。

因此，基于泛基因组分析技术挖掘脆弱拟杆菌种内的核心基因及脆弱拟杆菌BFS17的株特异基因，并根据这些特异基因进行引物设计及检测条件优化，对在样本中高效、精准识别脆弱拟杆菌及脆弱拟杆菌BFS17具有重要应用的意义。

发明内容：