[发明专利]胞内抗体及其制备方法和用途

说明书

本申请涉及一种胞内抗体及其制备方法和用途，该胞内抗体包括识别mHTT的单克隆抗体的可变区重链的片段和溶酶体膜相关蛋白Ⅰ的信号序列，所述可变区重链的片段包括SEQ.ID NO.1～3中任意一个所示的氨基酸序列。本申请提供的Intrabody具有双向识别功能，不仅可以识别和结合mHTT，还能够特异性识别溶酶体，实现突变蛋白的靶向降解，提高突变蛋白降解效率。

技术领域

本申请涉及抗体工程及疾病防治领域，特别是涉及一种胞内抗体及其制备方法和用途。

背景技术

神经退行性疾病是一类由神经元结构或功能逐渐丧失甚至死亡而引起神经系统功能障碍的疾病，由于神经元或其髓鞘的丧失，神经退行性疾病随着时间的推移而恶化，最终导致神经功能障碍。常见的神经退行性疾病包括亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默症、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症等多种类型。除了少数家族性神经退行性疾病有明确的致病基因外，大多数疾病的发病机制尚不清楚，因此缺乏有效的治疗手段。然而由于突变蛋白的累积导致聚集体的产生是这些神经退行性疾病发展到一定时期之后共有的病理特征，然而，这些聚集体在中枢神经系统内相互作用，破坏细胞微环境，堵塞胞内外物质运输从而造成神经细胞的损伤和死亡，因此，清除这些聚集体对于治疗该类疾病至关重要。

亨廷顿舞蹈症(Huntington's disease，HD)是一种罕见的遗传性神经退行性疾病，可导致进行性运动障碍，精神异常和认知障碍。在世界范围内，该疾病的患病率估计为每100，000人2.7例。HD是以常染色体显性遗传方式进行遗传，由胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)三核苷酸重复序列在HD基因编码区(位于4p16.3)短臂的异常扩增引起。正常人HTT基因的CAG重复序列小于36，而当CAG重复大于36时，就有可能因为异常延展的CAG重复导致蛋白质构象的异常，从而产生错误折叠的突变HTT(mHTT)，这些突变蛋白在中枢神经系统发生相互作用，在HD患者的脑中形成不溶性聚集体或内含物，导致疾病的发生。这些聚集体在神经元细胞核和胞质内积聚并导致细胞功能障碍和细胞死亡，最终导致大脑纹状体部位严重萎缩。

尽管现在对HD发病机制的理解取得了重大进展，但对该疾病仍然没有有效的治疗方法。由于对polyQ疾病的广泛研究揭示了异常延展的polyQ对多种细胞功能的广泛损伤，导致了一种普遍的理论，即阻断异常扩展的polyQ蛋白的表达将是治愈HD的有效途径。因此，科学家们已经做出了相当大的努力来开发可以减少或阻止HD动物模型中mHTT表达的治疗方法。例如，使用与载体复合或由病毒载体表达以递送到中枢神经系统的siRNA、shRNA和microRNA等基于RNAi的疗法。截至目前，最有希望的策略是使用反义寡核苷酸(ASO)来抑制mHTT的表达，许多研究人员报告了ASO对不同疾病模型的治疗效果。而更令人兴奋是，研究报道在临床上鞘内给药ASO可以降低HD患者脑脊液中mHTT的水平。进一步验证了抑制突变HTT的表达可以减轻HD患者的神经病理特征和临床症状。虽然这些治疗方式都在不同程度对HD疾病的治疗起到了积极作用，但是目前这些研究热门的治疗方式都是靶向于mRNA水平，对mHTT的转录翻译进行抑制，在疾病的前期治疗会有较好的效果，但是这些治疗手段不能对已经表达的mHTT蛋白和已经形成的聚集体进行有效的降低。所以还需寻找一种可以靶向清除已经转录表达的mHTT蛋白以及由mHTT蛋白形成的不溶性聚集体。

目前，有一些研究报道了一些靶向HTT基因不同区域的胞内抗体Intrabody，例如(1)设计的靶向Exon1-polyQ区域的胞内抗体，在细胞水平上验证反而发现其促进聚集体的产生并且加速细胞的死亡。(2)靶向Exon1-polyP区域的胞内抗体，通过细胞和小鼠进行验证，结果它们均在不同程度识别并降低了mHTT的水平，但是由于很多基因都具有polyP区域，所以会产生非特异性结合，可能会引起其它正常基因的功能异常。(3)靶向Exon1 N-terminal区域的胞内抗体，根据报道，这几种抗体靶向可溶性的mHTT蛋白的效率较低。(4)靶向mHTT聚集体的胞内抗体，经过验证，这种抗体可以降低聚集体，但是当mHTT构象发生变化时，识别效率会大大降低。且上述这些胞内抗体片段均在30kDa左右，片段较大，不易操作，而且在细胞内通过细胞自身降解系统的降解效率低。