[发明专利]一种6-唾液酸转移酶突变体及其应用

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种6'‑唾液酸转移酶突变体及其应用。本发明所述的6'‑唾液酸转移酶突变体是由美人鱼发光杆菌damselae的6'‑唾液酸转移酶Pd2,6ST基因突变而来。本发明构建的6'‑唾液酸转移酶突变体相比于野生型的6'‑唾液酸转移酶具有较高的底物CTP耐受性，更适合应用于唾液酸乳糖的生产，也能够适配异位再生体系，实现CTP再生。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种6′-唾液酸转移酶突变体及其应用。

背景技术

在唾液酸乳糖的生产过程中，使用高浓度的底物5’-胞苷三磷酸二钠盐(CTP)会显著抑制6′-唾液酸转移酶Pd2,6ST(GenBank:AB012285.1)的催化效率。当底物浓度达到800mM时，该酶的转化率降低至原来的77％。因此为了进一步满足工业上大规模的生产，需要寻找一种高浓度CTP耐受性的6′-唾液酸转移酶。

半理性设计方法应用于改造6′-唾液酸转移酶的实例越来越多，它基于6′-唾液酸转移酶蛋白质的晶体结构或同源模型，找到潜在的关键氨基酸残基位点，进行定点突变，从而改变酶的活性和稳定性等。Li Ding等人基于美人鱼发光杆菌sp.JT-ISH-224来源的6′-唾液酸转移酶的蛋白质晶体结构，通过改变靠近受体底物结合口袋的残基而获得的突变体中，突变体A366G酶活性提高了21-115％，并且表达量相比于野生型酶提高了两倍以上(LiDing，et al.CARBOHYD RES,2015,408:127-133)。这证明了该方法在6′-唾液酸转移酶改造中的有效性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，基于美人鱼发光杆菌damselae的Pd2-6ST基因，构建一种改造后具有高浓度底物CTP耐受性的6′-唾液酸转移酶突变体。

本发明还要解决的技术问题是，上述6′-唾液酸转移酶突变体在生产制备唾液酸乳糖中的应用和在CTP异位再生体系中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种6′-唾液酸转移酶突变体，所述的突变体是由序列为SEQ ID NO:1的野生型6′-唾液酸转移酶突变而来。

其中，所述的突变是将第449位亮氨酸突变成丙氨酸。

其中，所述的6′-唾液酸转移酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

其中，编码上述6′-唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

一种重组载体，含有上述6′-唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列。

一种宿主细胞，含有上述重组载体或上述6′-唾液酸转移酶突变体的核苷酸序列。

上述6′-唾液酸转移酶突变体的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建包含所述6′-唾液酸转移酶的编码基因的重组质粒，所述重组质粒以大肠杆菌为宿主；

(2)以步骤(1)构建的重组质粒为模板，利用带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物对，通过环状PCR扩增得到包含有SEQ ID NO:5所示的碱基序列的PCR产物，之后将PCR产物采用DpnI酶消化模板，得到环状重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的环状重组质粒转化至宿主细胞BL21(DE3)感受态细胞中，获得含有6′-唾液酸转移酶突变体的基因工程菌。

其中，步骤(1)中，所述的重组质粒为pET-28a-Pd2,6ST。

其中，步骤(2)中，所述的环状重组质粒为pET-28a-Pd2,6ST-L449A。

上述6′-唾液酸转移酶突变体在生产制备唾液酸乳糖中的应用。