[发明专利]一种琼胶酶、琼胶酶基因以及制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种琼胶酶、琼胶酶基因以及制备方法和应用，本发明通过将栖红藻解琼脂菌的α‑琼胶酶基因重组于大肠杆菌工程菌，获得能够高效表达该基因的重组大肠杆菌工程菌E.coliBL21‑pET28a(+)‑AgaB，具有较高的经济价值和工业应用前景，为新酶的挖掘与应用拓宽了资源；该酶是GH96家族的分泌型胞内蛋白。此外，对该酶的基因序列进行对比发现，其与已经报道的α‑琼胶酶氨基酸序列最高相似性仅为54.15％。通过酶学性质研究，其最适反应温度为40℃；最适反应pH为7；金属离子Ca2+、Ba2+对其活性有促进作用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种来源于栖红藻解琼脂菌(Agarilytica rhodophyticola MCCC 1H00123)的琼胶酶，同时还涉及该酶的获取以及重组表达，还涉及该重组菌在生产琼寡糖上的具体应用，以及琼寡糖在食品、药品和化妆品上的应用。

背景技术

琼胶是一种由石花菜及其他红藻类植物其取出来的一种具有经济价值的海洋多糖。琼胶经过水解后生成聚合度为2～20的琼胶寡糖，具有水溶性好，生物利用度高等优点，可广泛应用于食品、药品和化妆品等领域。

琼胶寡糖具有许多独特的医疗保健功能，可作为功能性食品、药品和化妆品的原料，主要表现为：1)琼脂寡糖具有抗氧化作用，能够直接或通过提高抗氧化酶类的活性来清除活性氧自由基，还可以通过琼脂寡糖与自由基必须的金属离子螯合起到抑制氧化的效果。因此可以应用于抗疲劳等功能的保健食品中。2)琼脂寡糖能够抑制巨噬细胞和单核细胞中一氧化氮的产生量、前列腺素E2含量以及促炎症反应的细胞活性物质水平的提高，具有抗肿瘤、提高免疫力的功能。可以用于生产抗肿瘤、抗炎症、抗病毒等药品生产中。3)研究发现琼胶寡糖具有良好的保湿美白功效，能够抑制黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性，并且对细胞没有毒性。因此可以用作化妆品的优质原材料。4)琼脂寡糖具有一定的抑菌活性，能够抑制细菌生长。琼脂寡糖能够作为食品中良好的天然防腐剂，还可以降低食品热量。5)体内、体外实验证明新琼寡糖耐受消化酶的作用，可以改善肠道菌群结构，促进肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌的增值，抑制致病菌的生长。其中高聚合度的琼胶寡糖抑菌效果优于低聚合度的琼胶寡糖。因此琼胶寡糖可以作为开发新型益生元制剂的原料。

近年来，我国对琼脂的开发规模较小，产品多限于作为化工和医药等原料出口的琼脂和琼脂粉，附加值低，易污染环境。为合理利用琼脂资源，生产琼胶寡糖等高附加值产品对防止资源浪费、增加经济效益、保护环境等具有重要意义。目前工业上主要利用酸水解和酶解两种方式制备琼胶寡糖，酸水解法效率高、产量大，但会产生大量副产物，存在琼胶寡糖分离提纯困难、具有安全隐患等问题；而琼胶酶酶解方法具有催化效率高、底物特异性强、反应条件温和等优点，是降解琼脂多糖的首选方式。但大多数利用酶法降解琼脂多糖的研究还处于实验室研究阶段，主要问题是产琼脂酶的菌株大多数来自于海洋，菌株产酶性状不稳定、产酶量低，使生产琼胶酶的成本高，价格昂贵，难以实现商业化应用。因此，寻找一种水解活力高，性状稳定的琼胶酶基因，并实现异源表达成为生产琼胶酶的最经济高效的方法。

琼胶酶分为α-琼胶酶和β-琼胶酶，其中α-琼胶酶水解α-1,3糖苷键生成琼寡糖，β-琼胶酶水解β-1,4糖苷键生成新琼寡糖。研究报道琼四糖和琼六糖相比于其他琼胶寡糖具有更好的抗氧化性能，但由于目前发现的琼胶酶绝大多数为β-琼胶酶，仅有四个α-琼胶酶的性能被挖掘和报道，且其稳定性、酶活和产物特异性均有待提高，因此琼四糖和琼六糖的大量工业化制备和应用收到了严重的限制。

因此，合理开发从自然界筛选得到一种的α-琼胶酶新基因，进而对新酶的特性研究并将其应用到实际生产中，解决化学法生产所带来的严重环境问题，将是未来琼寡糖产业的发展方向，也是目前亟需解决的问题。

发明内容

针对琼寡糖现有生产技术的弊端，提供一种来源于栖红藻解琼脂菌的琼胶酶基因，同时提供一种包括该基因的重组质粒，还提供一种含有该基因的大肠杆菌工程菌及其获取方法。

较为具体地，本发明第一方面提供了一种琼胶酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。