[发明专利]基于内参确定微生物的高通量检测方法和系统及试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于内参确定微生物的高通量检测方法和系统及试剂盒。该方法包括：提供均添加有内参序列的待测样品、阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品含已知微生物，阴性对照品中不含微生物；基于各样品的核酸建库，进行高通量测序，获得原始测序数据；进行一级质控处理，获得各样品质控数据；将各样品质控数据中的内参特异检出序列与内参序列比对，进行第一质控处理，将阳性对照品质控数据与微生物核酸数据库比对，进行第二质控处理，将阴性对照品质控数据与微生物核酸数据库比对，进行第三质控处理；去除待测样品质控数据中的人源数据后，确定待测样品中微生物。通过该方法可以实现针对病原微生物的快速临床检测、准确性高。

技术领域

本发明涉及病原检测技术领域，尤其涉及一种基于内参确定微生物的高通量检测方法和系统及试剂盒。

背景技术

宏基因组二代测序(mNGS)为急难危重感染性疾病的病原微生物诊断提供了一种无需预知、无偏好、高通量的方法。不需要对病原体进行培养，可直接从患者的脑脊液、血液、肺泡灌洗液、组织等样本中提取核酸，且能够同时对多个样本进行测序。可以在24-48小时内快速检测样本中所有潜在的病原体(病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体和寄生虫)，包括新发病原体，具有良好的敏感性和特异性。

宏基因组二代测序在急难危重感染性疾病的病原检测分析的应用，特别强调检测的质量控制和质量保证。由于mNGS检测病原微生物流程涉及核酸提取、文库构建、上机测序流程的多个实验步骤，因操作失误、气溶胶或index hopping等因素导致的同批次样本的互换或交叉污染对检测结果有很大的误导性，因此需要对整个检测流程进行严格质控以确保检测结果的可靠性和准确性。

针对宏基因组测序在呼吸道疾病的快速检测的准确性和可靠性还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。结合宏基因组测序在病原微生物检测的流程特点，为了提高检测的准确性和可靠性，发明人在研究过程中创造性的设置了质控检测，例如：(1)添加碱基序列作为内参质控品，可以质控病原检测实验过程中是否存在交叉污染，内参的有无同时可以监控病原检测实验成功与否；(2)以已知多种微生物组成的样本作为阳性对照品，可用于监控病原检测实验过程成功与否；(3)以不含任何微生物的样品作为阴性对照品或空白对照品，可用于监控外源的或试剂的微生物污染。基于上述几点，本发明创造性的提出了一种质控病原检测的内参序列、阳性对照和阴性对照体系，对整个病原检测流程进行严格质控以确保检测结果的可靠性和准确性。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种基于内参的通过高通量测序确定微生物的方法。所提供的基于内参确定微生物的高通量检测方法，包括：

提供待测样品、阳性对照品和阴性对照品，所述待测样品、所述阳性对照品和阴性对照品中均添加有预定含量的内参序列，所述内参序列与微生物核酸序列库和人源核酸序列库均不存在交叉序列，所述阳性对照品中含有已知微生物的混合物，所述阴性对照品中不含有微生物；

获取所述待测样品、所述阳性对照品和所述阴性对照品的核酸，建库，并进行高通量测序，以便获得待测样品原始测序数据、阳性对照品原始测序数据、阴性对照品原始测序数据；

对所述待测样品原始测序数据、阳性对照品原始测序数据、阴性对照品原始测序数据进行一级质控处理，以便获得待测样品质控数据、阳性对照品质控数据和阴性对照品质控数据；

分别基于待测样品质控数据、阳性对照品质控数据和阴性对照品质控数据中所含有的内参特异检出序列与内参序列的比对结果，进行第一质控处理，基于阳性对照品质控数据与微生物核酸数据库的比对结果，进行第二质控处理，基于阴性对照品质控数据与微生物核酸数据库的比对结果，进行第三质控处理；

基于待测样品质控数据与人源核酸数据库的比对结果，去除人源核酸数据，并基于剩余数据与微生物核酸数据库的比对结果，确定所述待测样品中含有的微生物。