[发明专利]基于内参确定微生物的高通量检测方法和系统及试剂盒

权利要求书

1.一种基于内参确定微生物的高通量检测方法，其特征在于，包括：

提供待测样品、阳性对照品和阴性对照品，所述待测样品、所述阳性对照品和阴性对照品中均添加有预定含量的内参序列，所述内参序列与微生物核酸序列库和人源核酸序列库均不存在交叉序列，所述阳性对照品中含有已知微生物，所述阴性对照品中不含有微生物；

获取所述待测样品、所述阳性对照品和所述阴性对照品的核酸，建库，并进行高通量测序，以便获得待测样品原始测序数据、阳性对照品原始测序数据、阴性对照品原始测序数据；

对所述待测样品原始测序数据、阳性对照品原始测序数据、阴性对照品原始测序数据进行一级质控处理，以便获得待测样品质控数据、阳性对照品质控数据和阴性对照品质控数据；

分别基于待测样品质控数据、阳性对照品质控数据和阴性对照品质控数据中所含有的内参特异检出序列与内参序列的比对结果，进行第一质控处理，基于阳性对照品质控数据与微生物核酸数据库的比对结果，进行第二质控处理，基于阴性对照品质控数据与微生物核酸数据库的比对结果，进行第三质控处理；

基于待测样品质控数据与人源核酸数据库的比对结果，去除人源核酸数据，并基于剩余数据与微生物核酸数据库的比对结果，确定所述待测样品中含有的微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参序列包含固定序列和随机序列，所述内参序列不能比对到微生物核酸序列库和人源核酸序列库；

任选地，所述固定序列来自于植物基因组；

任选地，所述植物包括选自拟南芥、小麦、大麦、水稻中的至少一种，优选的，所述植物为小麦；

任选地，所述随机序列长度为6～30bp；优选地，所述随机序列长度为8～24bp；

任选地，所述随机序列位于所述固定序列的任意位置；

优选地，所述随机序列位于所述固定序列两端或者位于所述固定序列中间；

任选地，所述固定序列长度为50-300bp，优选的，所述固定序列长度为150-250bp；

任选地，所述内参序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24所示序列中的至少一种；

任选地，所述内参序列在所述待测样品中的添加量为10⁶-10¹²copies/ml，优选为10⁶-10¹⁰copies/ml，更优选的，添加量为1×10⁸copies/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳性对照品包括细菌、真菌、病毒和/或寄生虫的已知微生物的混合物；

所述阴性对照品为人源细胞；

任选地，所述待测样品选自脑脊液、血液、肺泡灌洗液、痰液、胸水、尿液、组织中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用物理破壁、化学试剂裂解联合酶解法分别提取所述待测样品、阳性对照品和阴性对照品中的核酸；

任选地，通过下述方法对所述待测样品、阳性对照品和阴性对照品中的核酸进行建库，包括：对DNA样本进行酶切片段化处理、末端修复、连接接头和文库纯化。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

基于所述待测样品质控数据、阳性对照品质控数据和阴性对照品的质控数据比对到内参序列的特异序列数，判断所述待测样品、阳性对照品和阴性对照品中的内参特异性序列是否为添加的内参序列，若是，判定检测合格；

任选地，基于所述阳性对照品质控数据比对到所述微生物核酸序列库的序列数，判定检测流程是否成功，若相应的微生物特异序列数为零，则判定为实验失败，若相应的微生物特异序列数符合预期值，则判定为实验成功；

任选地，基于所述阴性对照品质控数据比对到所述微生物核酸序列库的序列数，判定实验的背景情况。